VII. CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN ĐƯỢC ÁP DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH CÂY CHUỂN GEN
3.1.1.2. Xác định ảnh hưởng của phương pháp khử trùng bằng NaOCl trong thời gian 25 phút (lần1:10phút, lần 2:15 phút) với nồng độ khác nhau
trong thời gian 25 phút (lần1:10phút, lần 2:15 phút) với nồng độ khác nhau
Bảng 3.6: Kết quả khử trùng bằng NaOCl trong thời gian 25 phút (lần1:10phút, lần 2:15 phút) với nồng độ khác nhau Giống Nồng độ Tổng số
Mẫu sống Mẫu chết Mẫu nhiễm Số lượng (hạt) Tỷ lệ (%) Số lượng (mẫu) Tỷ lệ (%) Số lượng (mẫu) Tỷ lệ (%) DT22 10 500 484 96,8 16 3,2 248 49,6 15 500 467 93,4 33 6,6 186 37,2 20 500 452 90,4 48 9,6 78 15,6 KDĐB 10 500 434 86,8 66 13,2 254 50,8 15 500 430 86 70 14 194 38,6 20 500 398 79,6 102 20,4 84 16,8
Kết quả thí nghiệm cho thấy khi xử lý mẫu bằng NaClO, với nồng độ 10%, 15%, 20 % (bảng 3.6) giống DT22 có tỉ lệ mẫu nhiễm lần lượt bằng 49,6%, 37,2%, 15,6%, KDĐB có tỉ lệ mẫu nhiễm lần lượt là 50,8%, 38,6%, 16,8%. Khử trùng bằng NaClO 20% trong khoảng thời gian 25 phút là thích hợp cho cả hai giống với tỉ lệ mẫu sống ở giống DT22 (90,4%), tỉ lệ mẫu nhiễm (15,6%) và ở giống lúa KDĐB tỉ lệ mẫu sống đạt (79,6%), tỉ lệ mẫu nhiễm (16,8%)
Hai giống lúa trên tương đối “sạch bệnh” nên khi xử lý bằng HgCl2
0,1% hay NaClO 20% đều cho hiệu quả tốt. Đối với giống lúa DT22 có sức nảy mầm và khả năng chống chịu tốt với các chất khử trùng nên có tỉ lệ mẫu sống cao hơn và tỉ lệ mẫu nhiễm thấp hơn giống KDĐB.
Khi xử lý bằng HgCl2 0,1% ở hai giống nghiên cứu cho thấy, khi kéo dài thời gian khử trùng từ 6 – 10 phút thì tỉ lệ mẫu nhiễm giảm (từ 10,4% xuống 1,8% tuỳ từng giống). Tuy nhiên mẫu chết do tác động gây độc của HgCl2 0,1% tăng lên (từ 11,4% - 67% tuỳ thuộc từng giống).
Khử trùng bằng NaClO trong thời gian 25 phút (lần1:10phút, lần 2: 15 phút) với nồng độ thay đổi (từ 10%, 15%, và 20%), tỉ lệ nhiễm bệnh của hai giống đều cao (từ 15,6% – 50,8% ) so với khử trùng bằng HgCl2 0,1%. Tuy nhiên tỉ lệ mẫu sống cũng tăng lên (từ 79,6% – 96,8%).
Xét về mức độ độc hại khi sử dụng hóa chất trong thực nghiệm thì Javen ít độc hại hơn thủy ngân clorua; hơn nữa Javen là hóa chất dễ tìm kiếm và có giá thành thấp. Từ những phân tích trên chúng tôi quyết định chọn Javen nồng độ 20%, thời gian khử trùng là 25 phút (lần1:10phút, lần 2:15 phút) là phương pháp thích hợp khử trùng cho hai giống lúa nghiên cứu trên. Vấn đề đặt ra là: tại sao sau khi làm thí nghiệm nhiều lần mà mẫu vẫn bị nhiễm với tỷ lệ khá cao, có những đĩa thí nghiệm từ 7 – 10 ngày đầu không bị nhiễm, sang đến ngày thứ 11 – 14 mới bị nhiễm đặc biệt đối vơi những thí nghiệm xử lý bằng NaOCl vơi nồng độ thấp hơn 20%. Khi xem xét các mẫu bị nhiễm, chúng tôi đi đến kết luận: hầu như tất cả các mẫu đều bị nhiễm bởi nấm và có hiện tượng nội nhiễm, nhiễm muộn.
Kết luận chung
Khử trùng bằng NaClO trong thời gian 25 phút (lần1:10phút, lần 2: 15 phút) với nồng độ 20% là thích hợp cho hai giống lúa nghiên cứu
Thời gian nuôi cấy tạo callus ở hai giống lúa nghiên cứu trên thích hợp nhất là 7 – 10 ngày. Nếu càng kéo dài thời gian nuôi cấy thì tỉ lệ nội nhiễm, nhiễm muộn càng tăng.
Không nên xử lý mẫu bằng NaClO vơi nồng độ thấp hơn 20% vì NaClO nồng độ thấp khả năng thấm sâu, diệt khuẩn và các bào tử nấm trong hạt gạo kém nên tỉ lệ nội nhiễm cao.
Ngoài ra, để đảm bảo khả năng sống của hạt lúa khi nuôi cấy không nên khử trùng bằng HgCl2 0,1% với thời gian quá lâu (≥ 6 phút).