VII. CÁC KỸ THUẬT DI TRUYỀN ĐƯỢC ÁP DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH CÂY CHUỂN GEN
3.1.3. Xác định môi trường nhân callus thích hợp.
Callus sau 7 – 10 ngày được tách ra tử mẫu nuôi cấy chuyển sang môi trường nhân callus (N). Khi tách chỉ tách lấy phần callus còn các phần khác không sử dụng và cấy callus vào các đĩa Petri có chứa môi trường N đã được trình bày ở phần 2.2.2.3. Mục đích tiến hành thí nghiệm nhân callus là làm tăng số lượng và kích thước callus phục vụ cho thí nghiệm chuyển gen. Qua thí nghiệm nhân callus cho thấy có các loại callus khác nhau được tạo ra:
Về mầu sắc: có màu trắng đục, vàng nhạt, nâu đen. Về hình dạng callus: có nốt hoặc không có nốt.
Về đặc điểm khác của callus: dạng khô và xốp hoặc chắc
Bảng 3.8: Kết quả nhân callus trên các môi trường khác nhau
Giống Σ số mẫu callus cấy/1 môi trường (mẫu)
Tỉ lệ callus sống trên các môi trường N
Môi trường N1 Môi trường N2 Môi trường N3
Số mẫu Callus sống (mẫu) Tỉ lệ (%) Số mẫu Callus sống (mẫu) Tỉ lệ (%) Số mẫu Callus sống (mẫu) Tỉ lệ (%) KDĐB 300 187 62,3 231 76,7 289 96,3 DT22 300 212 70,6 253 84,2 295 98,3 5 6
Hình 3.7 Biểu đồ nhân callus trên các loại môi trường N khác nhau
Từ bảng số liệu trên chúng tôi đi đến kết luận: Cả ba môi trường đều nhân được callus. Môi trường N1 và N2 không có 2,4-D có tỉ lệ nhân mô sẹo thấp hơn, giống KDĐB chỉ đạt 62,3 – 76,7%, giống DT22 là 70,6 - 84,2%; đặc biệt đối với giống KDĐB thì có rất nhiều callus bị đen hoặc không có khả năng tái sinh tạo chồi. Môi trường N2 tỉ lệ nhân callus cao hơn, kích thước mô sẹo tăng lên 3 – 4 lần có màu trắng sáng tròn và chắc. Kết quả này có thể được giải thích do trong môi trường N2 có hàm lượng BAP cao hơn trong N1, BAP là chất kích thích sinh trưởng nó giúp callus phát triển về kích thước. Khi BAP kết hợp với hàm lượng casein và prolin thích hợp sẽ kích thích callus phát triển tốt hơn. Tuy nhiên BAP ở nồng độ cao sẽ kích hoạt callus tái sinh chồi sớm trước khi chuyển gen nên trong thí nghiệm này đã sử dụng ABA để hãm sự tái sinh và tăng cường khả năng chống chịu của mô.
Trong môi trường N3 tỉ lệ nhân callus cao (đạt từ 96,3% – 98,3% tuỳ từng giống), callus có màu vàng sáng khô và xôp. Sau 8 – 10 ngày nuôi cấy kích thước mô sẹo tăng lên 3 – 4 lần so với ban đầu
Qua kết quả thí nghiệm cho thấy môi trường không có 2,4-D tỉ lệ nhân callus thấp nếu tăng nồng độ BAP thì callus sẽ tái sinh chồi sớm, khắc phục hiện tượng tái sinh chồi của callus bằng cách bổ sung ABA, callus cứng thành tế bào của callus dày sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen. Môi trường N3 thích hợp để nhân callus cho thí nghiệm chuyển gen. 2,4-D ở nồng độ cao gây độc mô
phôi nuôi cấy dễ bị “say” là chất ức chế gây rụng lá ở cây hai lá mầm, đối với cây một lá mầm ít mẫn cảm hơn. Thí nghiệm trên cho thây nồng độ 2,4-D 2mg/l ít ảnh hưởng đến mô nuôi cấy của hai giống lúa đang nghiên cứu
Hình 3.8: Callus của giống lúa KDĐB và DT22 được nhân trên môi trường N3
Hình 3.9: Callus của hai giống lúa KDĐB và DT22 được nhân trên môi trường N2
KDĐB DT22
Hình 3.10: Callus của hai giống lúa KDĐB và DT22 được nhân trên môi trường N1