PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. đối tượng nghiên cứu
- Lợn rừng sau cai sữa nuôi tại một số trang trại thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang.
3.2. địa ựiểm nghiên cứu
đề tài ựược tiến hành tại:
- Một số trang trại nuôi lợn rừng thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang. - Phòng thắ nghiệm bộ môn Nội chẩn - Dược - độc Chất - Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội.
- Phòng vi trùng Ờ Viện Thú y Quốc gia.
- Phòng thắ nghiệm bộ môn Bệnh lý Ờ khoa Thú y Ờ Trường đại học Nông nghiệp Hà nội.
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1 Khảo sát thực trạng ựàn lợn rừng nuôi tại một số trang trại thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang. tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang.
3.3.2. điều tra tình hình mắc hội chứng tiêu chảy trên ựàn lợn rừng nuôi tại một số trang trại thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang. tại một số trang trại thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang.
3.3.3. Xác ựịnh sự biến ựộng về số lượng, số loại vi khuẩn hiếu khắ, E.coli và samonella/1gram phân ở lợn rừng khỏe mạnh bình thường và tiêu và samonella/1gram phân ở lợn rừng khỏe mạnh bình thường và tiêu chảy theo các lứa tuổi.
3.3.4. Xác ựịnh mức ựộ mẫn cảm của vi khuẩn E.coli phân lập ựược ở lợn rừng bị tiêu chảy với một số loại kháng sinh. rừng bị tiêu chảy với một số loại kháng sinh.
3.3.5. đặc ựiểm bệnh lý bệnh viêm ruột tiêu chảy do E.coli gây ra trên ựàn lợn rừng sau cai sữa nuôi tại một số trang trại thuộc tỉnh Bắc Ninh lợn rừng sau cai sữa nuôi tại một số trang trại thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 37
3.3.5.2. Xác ựịnh sự biến ựổi của tần số hô hấp và tần số tim mạch ở lợn rừng mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do E.coli.
3.3.5.3. Xác ựịnh sự biến ựổi của một số chỉ tiêu sinh lý máu ở lợn bệnh (số
lượng hồng cầu, tỷ khối huyết cầu, thể tắch trung bình của hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu, ...).
3.3.5.4. Xác ựịnh sự biến ựổi một số chỉ tiêu sinh hóa máu ở lợn mắc bệnh (hàm lượng protein tổng số, các tiểu phần protein trong huyết thanh,
ựộ dự trữ kiềm trong máu, hàm lượng ựường huyết, ...). 3.3.5.5. Xác ựịnh tổn thương bệnh lý ựường ruột.
- Xác ựịnh tổn thương ựại thể ựường ruột. - Xác ựịnh tổn thương vi thể ựường ruột.
3.3.6. Xây dựng phác ựồựiều trị thử nghiệm.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp khảo sát thực trạng ựàn lợn rừng nuôi tại một số trang trại thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang. trại thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang.
Chúng tôi căn cứ vào số liệu thống kê của Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn của các tỉnh.
3.4.2. điều tra tình hình mắc hội chứng tiêu chảy trên ựàn lợn rừng nuôi tại một số trang trại thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang. tại một số trang trại thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang.
Chúng tôi tiến hành ựiều tra trực tiếp và quan sát thực ựịa tại các trang trại của các tỉnh ựồng thời dựa vào các triệu chứng ựiển hình của bệnh, kết hợp với việc mổ khám kiểm tra bệnh tắch ựể xác ựịnh bệnh.
3.4.3. Xác ựịnh sự biến ựộng số lượng, số loại vi khuẩn hiếu khắ, E.coli và Salmonella/1gram phân lợn rừng khỏe mạnh và lợn rừng tiêu chảy. Salmonella/1gram phân lợn rừng khỏe mạnh và lợn rừng tiêu chảy.
3.4.3.1. Phương pháp lấy mẫu phân.
- Mẫu phân ựược lấy trực tiếp ở hậu môn hoặc lấy ngay sau khi lợn mới thải. - Mẫu phân lấy ựược bảo quản trong lọ thủy tinh vô trùng, và ựược bảo quản ở nhiệt ựộ 40c.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
3.4.3.2. Phương pháp nuôi cấy xác ựịnh số lượng vi khuẩn/1gram phân. * Chuẩn bị:
- Mẫu phân với lượng 5 gram.
- Ống nghiệm ựịnh lượng 20ml vô trùng.
* Pha loãng mẫu:
- Trước khi lấy phân ở lọ vô trùng cân ựể pha loãng chúng tôi ựã dùng cốc inox nghiền ựánh kỹ mẫu phân tránh hiện tượng kết dây (vì cơ chất còn lẫn trong phân).
- Cân 1 gram phân cho vào ống nghiệm ựịnh lượng vô trùng, sau ựó dùng ựũa thủy tinh nghiền nát, trộn ựều thêm nước sinh lý vừa ựủ 10ml ta ựược ựộ pha loãng mẫu 10-1, dùng syringe vô trùng trộn ựều nhiều lần. Hút lấy 1ml dịch pha loãng này chuyển sang ống nghiệm vô trùng thứ 2 ựựng 9ml nước cất Ờ trộn ựều Ờ tiếp tục hút chuyển dịch như vậy ựến nồng ựộ pha loãng thắch hợp ựể nuôi cấy.
*Cách nuôi cấy:
- Cấy trực tiếp vào môi trường nước thịt: dùng que cấy chấm vào dịch pha loãng ở nồng ựộ thắch hợp rồi ựem cấy trực tiếp vào ống nghiệm chứa môi trường nước thịt pepton.
- Cấy trực tiếp vào môi trường thạch: dùng Micropipet hút 0,1ml dịch pha loãng ở nồng ựộ chuẩn vào 1 ựĩa môi trường. Mỗi nồng ựộ ở mỗi môi trường cấy trên 3 ựĩa lồng. Sau ựó ựể các ựĩa thạch vào tủ ấm 37oC/24h.
* Xác ựịnh số lượng:
Chúng tôi sử dụng phương pháp Koch: ở mỗi nồng ựộ chuẩn cho từng loại phân, rồi cấy ra 3 ựĩa thạch ựếm số lượng khuẩn lạc (CFU) trong 3 ựĩa thạch rồi lấy trung bình. Số lượng CFU tương ựương với số lượng vi khuẩn.
* Tắnh kết quả:
Nếu tiến hành pha loãng mẫu ở nồng ựộ x và cấy 0,1ml mẫu pha loãng vào môi trường, ựể tủ ấm nuôi cấy sau 24h thì khi ựó số lượng vi khuẩn (X) trong 1 gram phân ựược tắnh theo công thức:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 39 X = 10 x C
Trong ựó X: tổng số vi khuẩn có trong một gam phân.
C: là tổng số khuẩn lạc trung bình trên 1 ựĩa thạch Petri. a: nồng ựộ pha loãng 10-x.
3.4.3.3. Phương pháp xác ựịnh số loại vi khuẩn trong mẫu phân
Sau khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch thường ựể trong tủ ấm 370C/18 Ờ 24h, quan sát hình thái và kắch thước khuẩn lạc ta có thể phân loại và xác ựịnh ựược số lượng của từng loại. Sau ựó tiến hành phân lập, giám ựịnh các khuẩn lạc ựó bằng cách chọn các khuẩn lạc ựiển hình cho cấy sang các môi trường chuyên dụng.
* Môi trường thạch thường:
+ E.coli: khuẩn lạc dạng S, có thể dạng R, tròn, ướt, màu tro hay trắng nhạt, hơi lồi.
+ Salmonella sp: khuẩn lạc dạng S, có thể dạng R, tròn, trong hoặc hơi xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa.
+ Staphylococcus sp: khuẩn lạc dạng S, tròn bóng, rìa gọn, mặt lồi, có màu vàng.
+ Streptococcus sp: khuẩn lạc dạng S, nhỏ, màu hơi xám, bóng,...
* Môi trường thạch MacConkey:
+ E.coli: hình thành những khuẩn lạc dạng S, màu hồng cánh sen. + Salmonella sp: khuẩn lạc tròn, trong không màu, nhẵn bóng, hơi lồi ở giữa.
* Môi trường thạch Birrilliant Green Agar:
+ E.coli: khuẩn lạc dạng S, màu vàng chanh.
+ Salmonella sp: khuẩn lạc dạng S, màu hồng nhạt.
* Môi trường Chapman:
+ Staphylococcus sp: khuẩn lạc to, rìa gọn, nếu là tụ cầu gây bệnh làm môi trường biến màu vàng, nếu là tụ cầu không gây bệnh môi trường màu ựỏ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ 40
+ Streptococcus sp: vi khuẩn mọc tốt, khuẩn lạc nhỏ, mịn, ướt, mặt hơi lồi, trong sáng.
Từ môi trường chuyên dụng chúng tôi tiến hành ỘbắtỢ khuẩn lạc ựiển hình của E.coli và Salmonella sp cấy chuyển vào môi trường nước thịt ựể làm kháng sinh ựồ.
3.4.4. Phương pháp kiểm tra tắnh mẫn cảm, tắnh kháng thuốc của E.coli phân lập ựược từ phân lợn rừng sau cai sữa bị tiêu chảy với một số kháng phân lập ựược từ phân lợn rừng sau cai sữa bị tiêu chảy với một số kháng sinh.
Tiến hành làm kháng sinh ựồ dựa theo nguyên lý của Kirby Ờ Bauer.
a) Chuẩn bị:
Môi trường thạch thường pH = 7,2 ổ 0,2 ựược ựổ vào các ựĩa Petri với lượng 20ml, ựộ dày 4mm.
Giấy tẩm kháng sinh: khi sử dụng ựể ở nhiệt ựộ phòng. Canh trùng nuôi ở 370C/18 Ờ 24h.
Buồng cấy vô trùng, khử trùng bằng ựèn tử ngoại (UV).