- Autoclave - Tủ lạnh - Bếp từ
- Bể điều nhiệt 42oC - Tủ ấm 37oC
- Tủ cấy - Bếp đun - Bể ởn nhiệt
42
2.2. Phương pháp thực hiện
2.2.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu a) Lấy mẫu a) Lấy mẫu
Chuẩn bị đầy đủ các dụng cụ lấy mẫu khi đi lấy mẫu về phân tích. Chọn mợt địa điểm sạch, trớng và an toàn đặt thùng lấy mẫu xuớng. Tiến hành lấy mẫu.
Phải lấy mẫu ở tất cả các vị trí. Khi lấy mẫu cho vào túi PE, tránh khơng để tay chạm vào miệng túi và tránh khơng để mẫu dính lên miệng túi dễ gây nhiễm mẫu và kết quả sẽ khơng chính xác. Khơng được lấy quá ít mẫu, tới thiểu phải là 200g.
Sau khi lấy mẫu, hàn miệng túi PE lại, dùng bút ghi rõ tên sản phẩm, nhà sản xuất, ngày sản xuất lên túi mẫu.
Cất mẫu vào thùng đựng mẫu, cho dụng cụ vào mợt túi PE khác và khơng dùng lại dụng cụ này.
Sau khi lấy mẫu xong, cho tấc cả các túi mẫu vào thùng giữ nhiệt và đậy kín lại sau đó đem đến nơi phân tích mẫu.
b) Bảo quản mẫu
Mẫu sau khi lấy xong, nếu khơng phân tích ngay, cho vào ngăn đá tủ lạnh bảo quản mẫu. Chú ý mẫu phải được phân tích trong vòng 24h từ khi lấy.
2.2.2. Chuẩn bị mẫu
Rã đơng trước khi phân tích, rã ở nhiệt đợ phòng.
Cân mẫu:các dụng cụ lấy mẫu cân, đựng mẫu phân tích và nơi cân cần đảm bảo vơ trùng. Lượng mẫu cần cân tùy theo loại vi sinh cần phân tích.
43
2.2.3. Phương pháp
Định tính Salmonella bằng phương pháp trải đĩa và test sinh hóa. Đây là phương pháp dùng để định tính và kết luận phát hiện hay khơng phát hiện Salmonella trong mợt lượng mẫu xác định.
Cấy mẫu vào mơi trường tăng sinh chọn lọc RV, phân lập trên mơi trường XLD và khẳng định bằng các mơi trường thử nghiệm sinh hoá (mơi trường TSI, Ure Broth, lên men Mannitol, LDC both, thử nghiệm Indol, thử nghiệm Voges- Proskauer).
44
2.2.4. Qui trình thu thập mẫu và tiến hành kiểm nghiệm Salmonella
Hình 2.1. Qui trình thu thập mẫu và tiến hành kiểm nghiệm Salmonella.
Sản phẩm thủy sản
Thu tại các chợ và siêu thị
Đánh giá các chỉ tiêu
Cảm quan Vi sinh
Test Salmonella
45
2.2.5. Qui trình phân tích
Hình 2.2. Qui trình phân tích phát hiện Salmonella
Cấy 0,1ml dung dịch tăng sinh sang mơi trường tăng sinh chọn lọc (RV), ủ ở 42oC, 18 - 24 giờ.
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 mơi trường chọn lọc phân biệt (XLD,HE,BS,SS...),ủ ở 37oC, 24 giờ.
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy sang BHI hay TSA, ủ qua đêm.
Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:
- Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/khơng H2S, sinh hơi/khơng.
- Urea:(-), indol: (-), VP: (-), LDC: (+), ODC: (+), Manitol: (+), Sobitol: (+).
Thử nghiệm ngưng kết kháng nguyên huyết thanh: Poly: O, Poly: H.
Kết luận: Salmonella dương tính/ âm tính trong 25g mẫu.
Đờng nhất 25g mẫu trong 225ml mơi trường tăng sinh (BPW), ủ ở 37oC, 18 - 24 giờ.
46
2.2.5.1 Thuyết minh qui trình a) Chuẩn bị mẫu a) Chuẩn bị mẫu
Dùng kéo vơ khuẩn cắt 25g mẫu (khơng lấy mỡ, lấy cả chất lỏng nếu cĩ), cho vào bao nylon vơ khuẩn. Thêm vào 225ml mơi trường PBW đã hấp khử trùng để nguợi. Tiến hành đờng nhất mẫu được đợ pha lỗng 10-1. Đem ủ ở nhiệt đợ 37oC trong 24 giờ.
b) Cấy mẫu
Tăng sinh: Cấy 0,1ml dịch mẫu cĩ nờng đợ 10-1 vào ớng nghiệm cĩ chứa 10ml mơi trường tăng sinh chọn lọc RV, Ủ ở 42 ± 0,5 oC trong 24 giờ.
Phân lập: Cấy mẫu từ mơi trường RV sang mơi trường thạch đĩa
XLD và ủ ở nhiệt đợ 37oC trong 24 giờ. Nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng của
salmonella trên mơi trường XLD: trịn, lời, trong suớt , có tâm đen đơi khi tâm đen quá lớn bao trùm cả khuẩn lạc, mơi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ (hờng)…
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang mơi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh khơng chọn lọc và ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ
c) Thử nghiệm khẳng định
Lấy khuẩn lạc từ mơi trường TSA cấy sang các mơi trường thử nghiệm sinh hóa. Thực hiện như sau:
Thử nghiệm trên mơi trường TSI
Hấp khử trùng mơi trường TSI ở 121oC trong 15 phút và phân phới mơi trường vào các ớng vơ trùng để làm ớng thạch nghiêng.
Dùng que cấy vòng cấy sinh khới từ khuẩn lạc của giớng thuần sâu vào đáy của ớng thạch nghiêng.
47
Thử nghiệm Urea Broth
Cấy vi sinh vật đã được phân lập vào mơi trường canh urea có chứa chất chỉ thị là bromocresol purple
Ủ ở 37oC trong khoảng 12h – 18h.
Thử nghiệm (+): Mơi trường chuyển sang màu vàng. Thử nghiệm (-): Mơi trường khơng đởi màu.
Lên men mannitol
Mơi trường sử dụng là mơi trường phenol red broth base có pH 7.4, chỉ thị mơi trường này là phenol red có màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH < 6.8.
Tiến hành cấy vào các ớng mơi trường các chủng vi sinh vật cần khẳng định.
Ủ 37oC trong 18 – 24h.
Khả năng lên men của chúng được đánh giá dựa vào sự sinh hơi và sinh acid.
Sinh acid (+): Mơi trường màu cam chuyển sang vàng. Sinh hơi (-): Có bọt khí trong ớng Durnham.
Thử nghiệm LDC
Sử dụng mơi trường Falkow.
Tiến hành cấy vào các ớng mơi trường các chủng vi sinh vật cần khẳng định.
Chất chỉ thị màu trong mơi trường là Bromocresol purple.
- Phản ứng (+): mơi trường giữ nguyên màu tím ban đầu, canh khuẩn đục.
48
Thử nghiệm khả năng sinh Indol
Cấy VSV thử nghiệm qua mơi trường canh trypton ủ khoảng 24 giờ ở 37oC.
Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt mơi trường, thêm vài giọt thuớc thử Kovac’s
Quan sát sau vài phút.
- Thử nghiệm (+): trên bề mặt mơi trường xuất hiện vòng màu đỏ cánh sen.
- Thử nghiệm (-): khơng xuất hiện vòng đỏ.
Thử nghiệm Voges – Proskauer
Cấy vi sinh vật vào trong mơi trường glucose phosphate (MR-VP Broth).
Ủ ở nhiệt đợ 37oC trong vòng từ 2 - 5 ngày.
Thêm vào canh khuẩn dung dịch thuớc thử anpha- naphtol 5% trong cờn và dung dịch KOH 40% hay NaOH 40 %. với tỷ lệ 3:1.
Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút.
- Thử nghiệm (+):xuất hiện màu đỏ hay hờng sáng trên mặt mơi trường.
- Thử nghiệm (-): mơi trường khơng đởi màu.
49
2.2.6. Nhận định tính sinh hóa đặc hiệu
Bảng 2.1. Phát hiện hay khơng phát hiện Salmonella trong 25g mẫu Tính chất sinh
hố
Dương hoặc âm tính
Tỷ lệ % với vi khuẩn
Salmonella
TSI lactose - 99,2
TSI sucrose - 99,5
TSI glucose + 100
TSI glucose sinh hơi
+ 91,2
TSI hydro-sulfua + 91,6
Phân giải urê - 100,0
Lên men mannitol +
Phản ứng Indol - 98,2
50
CHƯƠNG 3:
51
3.1. Kết Quả
3.1.1. Kết quả cảm quan
Về màu sắc của mẫu thì có màu đặc trưng của từng loại.
Về mùi của mẫu thì cũng có mùi đặc trung của từng loại, khơng có mùi ơi thiu...
Tóm lại các mẫu thủy sản được lấy trong tình trang rất tớt, khơng biểu hiện gì xấu.
Tuy nhiên, những giá trị cảm quan này khơng có mới quan hệ với khả năng bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh trên thủy sản đơng lạnh. Do đó, những giá trị cảm quan này chỉ cung cấp các thơng tin về trạng thái bên ngoài của mẫu.
3.1.2. Kết quả đánh giá mức đợ nhiễm Salmonella trên sản phẩm thủy sản đơng lạnh.
Chúng tơi tiến hành lấy mẫu thuỷ sản ở mợt sớ chợ và siêu thị. Thực
hiện các bước test Salmonella và cho mợt sớ kết quả như sau.
Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giớng từ dịch tăng sinh chọn lọc trên các đĩa mơi trường:
+ Mơi trường XLD: Chúng tơi tiến hành cấy trên 5 đĩa và phát hiện có 3 đĩa nhiễm Salmonella. Khuẩn lạc có màu hờng trong suớt, có hay khơng có tâm đen. Mợt sớ dòng có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.
52
Hình 3.1. Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên mơi trường XLD + Mơi trường HE: Tiến hành cấy trên 5 đĩa và phát hiện có 2 đĩa nhiễm
Salmonella. Khuẩn lạc có màu thay đởi từ xanh dương đến xanh lục, có hay khơng có tâm đen. Mợt sớ dòng có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.
53
Hình 3.2. Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên mơi trường HE + Mơi trường BS: Tiến hành trên 5 đĩa và phát hiện 3 đĩa nhiễm
Salmonella. Khuẩn lạc có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kím tím, mơi trường xung quanh khunẩ lạc chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển sang màu đen nếu kéo dài thời gian ủ.
54
Hình 3.3. Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên mơi trường BS
Đờng thời chúng tơi tiến hành trên mợt sớ thử nghiệm sinh hoá cho mợt sớ kết quả như sau:
+ Thử nghiệm trên mơi trường TSI:
55
Salmonella chỉ lên men được đường glucose trong mơi trường TSI do vậy phần nghiêng của mơi trường TSI có màu đỏ, phần sâu cĩ màu vàng.
Salmonella có khả năng sinh H2S do vậy xuất hiện các vệt màu đen trong mơi trường TSI.
Có thể thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch mơi trường hoặc mơi trường bị đẩy lên trên tạo ra mợt khoảng khơng bên dưới ớng nghiệm.
+ Thử nghiệm Urea Broth:
Hình 3.5. Thử nghiệm Urea Broth
Vì Salmonella khơng phân giải urea nên khơng làm thay đởi pH mơi trường. Sau khi nuơi cấy mơi trường vẫn giữ nguyên màu tím.
56
+ Lên Men manitol:
Hình 3.6. Lên men manitol
Mơi trường sau khi nuơi cấy salmonella bị acid hóa và chuyển thành màu vàng.
57
+ Thử nghiệm LDC:
Hình 3.7. Thử nghiệm LDC
Sau khi nuơi cấy Salmonella mơi trường chuyển thành kiềm, mơi trường vẫn giữ nguyên màu tím.
+ Thử nghiệm khả năng sinh Indol:
58
Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt mơi trường, thêm vài giọt thuớc thử Kovac’s
Quan sát sau vài phút.
- Thử nghiệm (+): trên bề mặt mơi trường xuất hiện vòng màu đỏ cánh sen.
+ Thử nghiệm Voges – Proskauer:
Hình 3.9. Thử nghiệmVoges – Proskauer
Sau khi cho thêm vào canh khuẩn dung dịch thuớc thử anpha- naphtol 5% trong cờn và dung dịch KOH 40% hay NaOH 40 %. với tỷ lệ 3:1.
Quan sát phản ứng xảy ra trong 5 phút.
59
Đánh giá theo TCVN 4829:2001 (ISO 6579:1993) với quy đinh mức đợ nhiễm Salmonella là 0 CFU/25g
Nhưng với mợt sớ mẫu mà chúng tơi đã lấy và tiến hành phân tích thì có mợt sớ mẫu bị nhiễm Salmonella chiếm khoảng 20 - 30%.Việc tạp nhiễm
Salmonella có thể là đo nguờn phân phới khơng hợp vệ sinh, khơng dùng các dụng cụ bảo hợ lao đợng. Hay cũng có thể do nhiễm từ nguờn khơng khí, và mơi trường xung quanh khu vực buơn bán. Tình trạng nhiễm Salmonella trên chứng tỏ mức đợ VSATTP còn rất thấp, vì tỉ lệ theo TCVN là 0 CFU/25g.
Còn lại những mẫu âm tính với Salmonella có thể sử dụng được, nhưng cũng phải đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, vì khơng chỉ có
Salmonella mới gây ra những ca ngợ đợc thực phẩm nghiêm trọng, khơng nhiễm Salmonella khơng có nghĩa là khơng nhiễm các vi sinh vật khác.
60
CHƯƠNG 4:
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
61
4.1. Kết luận
Sau quá trình nghiên cứu chúng tơi nhận thấy rằng sớ lượng nhiễm
Salmonella chiếm khoảng 20 – 30%, diều này chứng tỏ vấn đề về VSATTP cịn thấp. Bởi vì Salmonella là mợt lồi vi khuẩn khá nguy hiểm, chúng gây ra bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết và mợt sớ bệnh khác. Đáng nói là loài này thường tạp nhiễm vào thực phẩm, điều này vơ cùng nguy hiểm vì theo TCVN, mức đợ nhiễm Salmonella là 0 CFU/25 g.
Mạng lưới kiểm tra an tồn vệ sinh thực phẩm tuy trải rợng khắp cả nước, nhưng năng lực kiểm dịch chưa được cao ở các địa phương , nhất là ở các thành phớ lớn.
4.2. Đề nghị
Tiến hành thử nghiệm với mợt sớ lượng mẫu lớn hơn.
Tiến hành thêm các thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh và nhuợm.
Ngồi ra, cần tiến hành nhiều thử nghiệm kiểm tra chỉ tiêu samonella
trên các loại thực phẩm khác như thịt chế biến, thịt đơng lạnh, trứng tươi,... Lập ra mạng lưới kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm dày đặc, năng lực kiểm tra cao.
62
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Tài liệu tiếng việt
[1]. Trần Linh Thước, 2007, Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm.
[2]. Nguyễn Thị Linh Phương, 2006, đờ án ớt nghiệp, Đánh giá mức đợ nhiễm Salmonella trên các quầy thịt ở chợ Văn Thánh.
[3]. Nguyễn Hữu Liêm, 2006, khoá luận tớt nghiệp, Tìm hiểu về vi khuẩn
Salmonella.
[4]. Lê Đình Hùng, Vương Thị Việt Hoa, Phạm Vân Ánh, Trần Hoàng Kim Sa, Tìm hiểu các biện pháp nhằm tăng cường khả năng phát hiện Salmonella trong sản phẩm thủy sản đơng lạnh, Tạp san Khoa Học Kỹ Thuật Nơng Lâm Nghiệp, sớ 2/2001.
[5]. Phan Thị Thu Quế, 2005, Cơng nghệ chế biến thuỷ hải sản đơng lạnh. [6]. PGS.TS Võ Thị Dương Huy, 2007, Vi khuẩn học.
2. Tài liệu Internet
[7]. http://www.thuvientailieu.com.vn [8]. http://www.trieufile.com.vn