e) Các loại vitamin và khoáng chất
1.2.10. Tình hình nhiễm Salmonella ở Việt Nam và trên Thế Giới
1.2.10.1. Tình hình nhiễm Salmonella ở Việt Nam
Theo Cục trưởng Cục ATVSTP cho biết, hiện nay, mạng lưới kiểm nghiệm ATVSTP đã được hình thành rợng khắp trong cả nước nhưng thực tế năng lực kiểm nghiệm nhiều chỉ tiêu về an tồn thực phẩm tại các địa phương vẫn rất hạn chế. Trong 330 mẫu hoa quả cĩ tới 2,7% sớ mẫu cĩ tỷ lệ tờn dư thuớc bảo vệ thực vật cao, nhất là ở táo đỏ, quýt và lê. Đặc biệt, trong sớ 1.416 mẫu thịt và sản phẩm từ thịt đã phát hiện tới 40,9% sớ mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây ra các bệnh về đường tiêu hóa. Hơn nữa, khu vực TP Hờ Chí Minh và Đờng Nai là những địa phương có tỷ lệ mẫu thực phẩm nhiễm Salmonella cao nhất, chiếm từ 84 - 95% mẫu được giám sát.
27
1.2.10.2. Tình hình nhiễm Salmonella trên Thế Giới
Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở châu Âu giảm đều đặn từ những năm 1990 trở lại đây, trong năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm Salmonella trên người được phát hiện, sự sai lệch của báo cáo này là rất lớn, sớ lượng thực tế rất cĩ thể gấp 10 lần như thế. Ở Mỹ, tình trạng có khá hơn, ởn định ở mức 15 ca trên 100.000 người từ năm 2001 do kiểm sốt tớt Salmonella trong thực phẩm từ năm 1990, bao gờm các thực phẩm sữa, trứng, nước trái cây, sản phẩm tươi sớng, rau, bánh kẹo, và đặc biệt là thịt. Mợt đợt dịch gần đây ở Mỹ gây ra bởi S.typhimurium nhiễm trong bơ đậu phợng đã gây ảnh hưởng đến hơn 700 người trên khắp nước Mỹ.
Từ tháng 7/2009 tới nay, sớ ca nhiễm khuẩn Salmonella được phát hiện ở Mỹ đã tăng lên 184 người, thuợc 38 bang khác nhau. Cơ quan y tế của nước này vẫn chưa xác định nguyên nhân chính xác khiến sớ ca nhiễm khuẩn Salmonella tăng nhanh như vậy. Tuy nhiên, mới đây các chuyên gia y tế của bang Oregon cho rằng nguờn lây lan vi khuẩn Salmonella từ các sản phẩm xúc xích. Vừa qua, các cơ quan điều tra Mỹ đã thu hời hơn 560 tấn xúc xích do nghi bị nhiễm vi khuẩn Salmonella, tất cả sớ lượng này đều do Cơng ty Daniele International sản xuất.Tuy nhiên, ơng Jason Maloni, phát ngơn viên của cơng ty này khẳng định: “Chưa có bằng chứng nào chứng minh các sản phẩm xúc xích của chúng tơi bị nhiễm vi khuẩn Salmonella”. Sự bùng nở của sớ ca nhiễm khuẩn Salmonella ở khu vực tây bắc Thái Bình Dương đã khiến các cơ quan điều tra nghi ngờ rằng nguờn gây bệnh cho ở dịch này là từ các sản phẩm xúc xích sau khi họ phát hiện rất nhiều người ăn xúc xích mua tại các cửa hàng ở khu vực này bị nhiễm khuẩn Salmonella. Các nhân viên điều tra tại bang Washington cũng cho biết 14 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn Salmonella ở bang này, đã từng ăn xúc xích của hãng Daniele.
28
Ngồi ra, các chuyên gia y tế khẳng định họ đã kiểm tra và phát hiện khuẩn
Salmonella cĩ trong các mẫu xúc xích của cơng ty này. Hiện tại, các nhân viên điều tra liên bang Mỹ vẫn đang làm việc để tìm ra nguyên nhân chính xác gây ra dịch nhiễm khuẩn Salmonella ở nước này. Vì thế, họ vẫn chưa thể kết luận sản phẩm xúc xích của Cơng ty Daniele cĩ phải là nguờn lây bệnh chính hay khơng. Vì thế, những sản phẩm xúc xích của cơng ty này bị thu hời là do kiểm tra bị nhiễm khuẩn Salmonella.
1.2.11. Cách phòng ngừa
Vệ sinh phân, nước, rác. Khơng ăn thức ăn sớng, khơng uớng sữa chưa tiệt trùng. Luơn luơn rửa tay thật kỹ bằng xà bơng trước khi ăn, trước và sau khi làm đờ ăn và sau khi đi vệ sinh, thay tã hoặc chơi với thú nuơi trong nhà.
Nấu kĩ thực phẩm có nguờn gớc đợng vật trước khi ăn đặc biệt là thịt gia cầm, thịt lợn, trứng (ít nhất là đun tới 70oC), khơng dùng trứng sớng hoặc chưa nấu kĩ. Bức xạ tần sớ cao và axit hóa: chiếu tia bức xạ vào thịt gia cầm là phương pháp hiệu quả nhằm phá hủy, tiêu diệt Salmonella. Hơn nữa, vi khuẩn này khơng sinh sản ở pH < 4.
Làm lạnh thực phẩm: vi khuẩn này sinh sản chậm trong khoảng nhiệt đợ 5 – 120oC và nhanh ở nhiệt đợ thường. Chính vì lí do đó mà khơng nên để lâu trong tủ lạnh, nhất là ở nhiệt đợ thường. Thịt đơng lạnh phải được làm tan ỏ phòng lạnh chứ khơng được rửa bằng nhiệt đợ phòng hay bằng nước ấm.
Bảo quản thức ăn đã nấu chín trong các hợp chứa nhỏ. Tránh gây tái nhiễm vi khuẩn trong bếp sau khi thức ăn đã được nấu chín, để thực phẩm tươi sớng riêng với thực phẩm nấu chín.
29
Thanh tra vệ sinh và giám sát cẩn thận các lò mở, các nhà máy chế biến thức ăn, các cửa hàng thịt trứng.
Thức hiện đúng quy chế vệ sinh trong các khâu sản xuất vận chuyển, bảo quản, dự trữ.
Thường xuyên kiểm tra sức khỏe người chế biến hoặc tiếp xúc với thực phẩm, xét nghiệm phân để sớm phát hiện cách ly và điều trị người lành mang trùng.
Tuyên truyền giáo dục vệ sinh, ăn chín, uớng sơi, rửa tay trước khi ăn và sau khi đi vệ sinh.
Trong vùng có nhiều người mắc bệnh hoặc vùng bị lũ lụt, ơ nhiễm mơi trường nặng cần được sát khuẩn bằng dung dịch Cloramin B, vơi bợt. Ở những nơi bệnh thương hàn thường xuyên xảy ra nên tiêm phòng bằng vaccin, tùy từng hiệu lực của từng loại vaccin có thể tiêm nhắc lại sau 2 - 5 năm.
Sử dụng Vaccin phòng bệnh thương hàn do Vi khuẩn Salmonella gây ra được sử dụng chứa kháng nguyên V của S.typhi đưa vào cơ thể bằng đường tiêm với 1 liều 25mg có hiệu lực bảo vệ 70%.
Tại Việt Nam có 2 loại Vaccin thương hàn thường sử dụng :
- Vaccin thương hàn tiêm (injection): tên thương mại Typhim Vi –
NSX Viện Bào Chế Pasteur Merieux Connaught – Pháp.
- Vaccin thương hàn Zerotyph Cap – Uớng. Nhà bào chế Boryung Biopharma Co.Gtd – Hàn Quớc.
30
1.3. Phương pháp phát hiện Salmonella
1.3.1. Phương pháp truyền thớng 1.3.1.1. Nguyên tắc 1.3.1.1. Nguyên tắc
Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng mợt qui trình bao gờm 4 bước: bước tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Salmonella thường có mặt trong mẫu với sớ lượng nhỏ, bị tởn thương và cùng hiện diện chung với mợt sớ lượng lớn vi sinh vật thuợc họ
Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh, ức chế sự tăng trưởng của
Salmonella.
Bước tăng sinh:
Tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu mà cần chọn qui trình tăng sinh phù hợp. Thơng thường tỉ lệ giữa mẫu và mơi trường là 1:9 nhưng có thể thay đởi.
Bước tăng sinh chọn lọc:
Các mơi trường tăng sinh chọn lọc dùng dể phát hiện Salmonella trong mẫu thực phẩm là Rappaport Vassiliadis (RV), Selenite Cystein Broth,Tetrathionate Mueler Kauffmanm Broth (TT)…những nghiên cứu gần đây cho thấy mơi trường RV có thể thay thế cho các mơi trường khác. Hiện nay, người ta khuyến khích là nên dùng ít nhất 2 loại mơi trường tăng sinh chọn lọc để phát hiện tất cả Serotype Salmonella nếu có hiện diện trong mẫu.
Bước phân lập:
Nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu. Nhiều loại mơi trường rắn khác nhau được sử dụng để phân lập Salmonella. Hiện nay, vcác tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khuyến khích sử dụng ít nhất 2 loại mơi trường phân lập khác nhau để tăng cường
31
khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella, đặc biệt là mơi trường XLD được sử dụng nhiều nhất.
Bước khẳng định
Nhằm xác định lại các khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella xuất hiện trên mơi trường phân lập. Bước này được thực hiện trên các thử nghiệm sinh hóa và các thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salomonella. Các thử nghiệm sinh hóa được khuyến khích sử dụng là KIA/TSI, Indol, LDC (lysine decarboxylase), ODC (ornithine decarboxylase), urea, Manitol, sorbitol, các thử nghiệm huyết thanh O hay H.
1.3.1.2. Phương pháp thực hiện
a) Bước tăng sinh
Đới với mẫu thơng thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vơ trùng, bở sung 225ml dung dịch BPW và đờng nhất mẫu trong 15 hoặc 30 giây. Ủ ở 37oC trong 18 - 24 giờ. Đới với mợt sớ loại thực phẩm có chứa các chất có thể gây đợc hoặc ức chế sự tăng trưởng của Salmonella cần thực hiện qui trình tăng sinh đặc biệt như sau:
- Đới với mẫu gia cầm tươi sớng: đặt gia cầm vào mợt bao nhựa lớn, thêm vào 1 lít mơi trường tăng sinh BPW. Lắc bằng máy lắc khoảng 30 giây để mơi trường thấm được vào trong toàn bợ mẫu.
- Đới với mẫu sữa khơ: cho 25g mẫu vào trong túi PE vơ trùng, bở sung 225ml mơi trường BPW, để yên 60 phút ở nhiệt đợ phòng. Sau đó lắc cho đến khi sữa tan hoàn toàn.
- Đới với các loại gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị: đờng nhất mẫu ở đợ pha loãng 1/100 trong BPW (thay vì 1/10 như bình thường) trước khi nuơi tăng sinh. Biện pháp này nhằm làm giảm nờng đợ các hợp chất ức chế sự tăng trưởng của Salmonella trong bước tăng sinh.
32
- Đới với các loại mẫu như casein, pho mat, bơ và các sản phẩm tương tự khác: thực hiện đờng nhất mẫu trong mơi trường tăng sinh đã được làm ẩm đến 40oC.
- Đới với sản phẩm chứa coca: đờng nhất mẫu trong mơi trường Skim Milk Broth được làm ẩm ở 40oC.
- Đới với dừa, các sản phẩm của dừa và các mẫu có hmà lượng chất béo cao: đờng nhất mẫu với BPW, sau đó thêm vào 2 - 3 giọt Triton X-100 trước khi ủ tăng sinh.
b) Bước tăng sinh chọn lọc
Lắc để trợn đều dung dịch tăng sinh, và chuyển 0,1ml sang 10ml mơi trường tăng sinh RV đã được ủ ấm đến 42oC. Ủ ở 42oC trong 18 - 24 giờ. Khi cần thiết cần kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ.
Mợt sớ mơi trường tăng sinh chọn lọc khác như Selenite Cysteine Broth, Tetrethionate Muller- Kauffman cũng được dùng. Mỡi loại mơi trường chỉ có tác dụng chọn lọc trên mợt đặc điểm phát triển của
Salmonella, mợt sớ dòng Salmonella trăng trưởng được trong mơi trường này nhưng lại khơng tăng trưởng được trong mơi trường khác.Do vậy, để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu thực phẩm cần phải dùng ít nhất 2 loại mơi trường tăng sinh chọn lọc khác nhau cho cùng mợt mẫu. Ngoài ra, mỡi mơi trường chọn lọc được ủ ở mợt nhiệt đợ nuơi cấy khác nhua như mơi trường RV được ủ ở 420C, mơi trường TT và SC được ủ ở 37oC trong 22 - 24 giờ.
c) Bước phân lập và nhận diện
Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giớng từ dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa mơi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella như XLD, HE, BS...Cường đợ chọn lọc và mức đợ
33
phân biệt thể hiện ở hình thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng mơi trường cũng khác nhau. Để chọn lọc và nhận dạng được tất cả các dòng Salmonella
phải dùng tới thiểu 2 mơi trường chọn lọc phân biệt khác nhau cho cùng mợt mẫu. Các biểu hiện của Salmonella trên từng mơi trường khác nhau như sau: - Mơi trường XLD: Khuẩn lạc có màu hờng trong suớt, có hay khơng có tâm đen. Mợt sớ dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.
- Mơi trường HE: khuẩn lạc có màu thay đởi từ xanh dương đến xanh lục, có hay khơng có tâm đen. Mợt sớ dòng Salmonella có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.
- Mơi trường BS: khuẩn lạc Salmonella có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kím tím. Mơi trường chung quanh khuẩn lạc chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển sang đen nếu kéo dài thời gian ủ.
- Mơi trường BPLS: có khuẩn lạc Salmonella màu hờng nhạt, trong suớt, xung quanh khuẩn lạc mơi trường chuyển sang màu đỏ.
- Mơi trường SS: Tất cả các đĩa mơi trường sau khi cấy được ủ ở 37oC trong 22-26 giờ. Sau khi ủ, chọn khuẩn lạc có đặc điểm của Salmonella như trên để thực hiện khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng nguyên.
d) Khẳng định
Từ mỡi mơi trường phân lập cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc đặc trưng qua mơi trường khơng chọn lọc như TSA. Ủ ở 37oC trong 18 - 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên mơi trường này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh.
34
Các thử nghiệm sinh hóa chính là: lên nem gloco, utea, manitol, indol, H2S, VP, ODC, LDC, saccharose, sorbitol. Các chủng Salmonella cho kết quả sau:
- Thử nghiệm H2S (KIA hay TSI) Salmonella chỉ lên men được dường gluco trong mơi trường trên vì thế phần nghiêng của mơi trường có màu đỏ, phần sâu vàng. Đa sớ các chủng Salmonella điều có khả năng sinh H2S nên có vạch màu đen trong mơi trường. Có thể quan sát thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch hoặc mơi trường bị đẩy lên.
- Thử nghiệm LDC (+): sau khi nuơi cấy, mơi trường bị kiềm hóa, khơng đởi màu (màu tím hay xanh).
- Thử nghiệm urea (-): Salmonella khơng phân giải urea nên khơng làm thay đởi ph của mơi trường nên mơi trường khơng đởi màu.
- Lên men manitol, sorbitol (+): mơi trường chuyển màu vàng vì bị acid hóa.
- Thử nghiệm Indol và VP (-).
- Các thử nghiệm kháng nguyên: cần được thực hiện song song với mẫu đới chứng bằng nước muới sinh lý để tránh hiện tượng ngưng kết giả. Hai loại huyế thanh đa giá cần dùng là Salmonella Polyvalent O và
Salmonella Polyvalent H. Phản ứng (+) khi chúng thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh nhưng khơng ngưng kết với nước muới sinh lý.
35
Bảng 1.4. Biểu hiện đặc trưng của Salmonella trong test sinh hĩa
Thử nghiệm Mơi trường Biểu hiện đặc trưng
H2S TSI/KIA Phần nghiêng đỏ, sâu vàng, nứt thạch và xuất hiện vạch đen
LDC LDC Khơng đởi màu
Urea Urea Khơng đở màu
Manitol,sorbitol Manitol, sorbitol Bị acid hĩa, mơi trường chuyển sang màu vàng
Indol Trypton Khơng xuất hiện vòng đỏ khi nhỏ thuớc thử Kovac’s
VP VP Khơng đởi màu khi nhỏ α – napthol 5% và KOH 40%
1.3.1.3. Báo cáo kết quả
Qui trình kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích định tính
Salmonella, giúp kết luận có hay khơng có Salmonella hiện diện trong 25g mẫu, khơng cho phép phân biệt được các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu. Để khẳng định được tên chủng Salmonella phân lập được cần phải tiến hành thử nghiệm ngưng kết với các loại kháng huyết thanh đơn giá khác nhau hay cần gửi các chủng Salmonella phân lập được đến các phòng thí nghiệm chuyên định danh vi sinh vật.
Cần lưu ý Salmonella là nhóm chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm. Do vậy cần tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Salmonella dùng làm đới chứng (+) cũng như khi thao tác trên các chủng phân lập được. Các mơi trường hay mẫu vật sau khi nuơi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa.
36
1.3.2. Phương pháp hiện đại
Bên cạnh những kỹ thuật sinh học phân tử cơ bản để phát hiện và định danh Salmonella, còn có những phương pháp khác, như: phương pháp miễn dịch (huyết thanh học, kỹ thuật ELISA, Western blot). Và đơi khi để tăng hiệu quả, đợ tin cậy cho xét nghiệm người ta đã kết hợp nhiều phương pháp với nhau, ví dụ: IMS-PCR assay (Immunomagnetic Separation and Polymerase Chain Reaction) để phát hiện Salmonella trong thực phẩm.
1.3.2.1. Phương pháp PCR
Phương pháp PCR là phương pháp tởng hợp DNA in vitro dựa trên khuơn là mợt trình từ DNA đích ban đầu, sau đó trình tự này được khuếch đại và nhân lên thành hàng triệu bản sao.
Mợt phản ứng PCR để cĩ thể thực hiện được phải cĩ: - DNA mẫu.
- Cặp mời (primers): mời xuơi và mời ngược. - Taq polymerase
- dNTP’s ( các nucleotide tự do)
Phản ứng PCR gờm nhiều chu kỳ lặp lại nới tiếp nhau. Mỡi chu kỳ là mợt quá trình gờm ba bước:
- Bước 1 (biến tính, denaturation): hỡn hợp được gia nhiệt lên đến