e) Các loại vitamin và khoáng chất
1.3.1.Phương Pháp truyền thớng
1.3.1.1. Nguyên tắc
Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng mợt qui trình bao gờm 4 bước: bước tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Salmonella thường có mặt trong mẫu với sớ lượng nhỏ, bị tởn thương và cùng hiện diện chung với mợt sớ lượng lớn vi sinh vật thuợc họ
Enterobacteriaceae có tính cạnh tranh mạnh, ức chế sự tăng trưởng của
Salmonella.
Bước tăng sinh:
Tùy theo đặc tính thành phần hóa học của mẫu mà cần chọn qui trình tăng sinh phù hợp. Thơng thường tỉ lệ giữa mẫu và mơi trường là 1:9 nhưng có thể thay đởi.
Bước tăng sinh chọn lọc:
Các mơi trường tăng sinh chọn lọc dùng dể phát hiện Salmonella trong mẫu thực phẩm là Rappaport Vassiliadis (RV), Selenite Cystein Broth,Tetrathionate Mueler Kauffmanm Broth (TT)…những nghiên cứu gần đây cho thấy mơi trường RV có thể thay thế cho các mơi trường khác. Hiện nay, người ta khuyến khích là nên dùng ít nhất 2 loại mơi trường tăng sinh chọn lọc để phát hiện tất cả Serotype Salmonella nếu có hiện diện trong mẫu.
Bước phân lập:
Nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu. Nhiều loại mơi trường rắn khác nhau được sử dụng để phân lập Salmonella. Hiện nay, vcác tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khuyến khích sử dụng ít nhất 2 loại mơi trường phân lập khác nhau để tăng cường
31
khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella, đặc biệt là mơi trường XLD được sử dụng nhiều nhất.
Bước khẳng định
Nhằm xác định lại các khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella xuất hiện trên mơi trường phân lập. Bước này được thực hiện trên các thử nghiệm sinh hóa và các thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salomonella. Các thử nghiệm sinh hóa được khuyến khích sử dụng là KIA/TSI, Indol, LDC (lysine decarboxylase), ODC (ornithine decarboxylase), urea, Manitol, sorbitol, các thử nghiệm huyết thanh O hay H.
1.3.1.2. Phương pháp thực hiện
a) Bước tăng sinh
Đới với mẫu thơng thường tiến hành cân 25g mẫu trong túi PE vơ trùng, bở sung 225ml dung dịch BPW và đờng nhất mẫu trong 15 hoặc 30 giây. Ủ ở 37oC trong 18 - 24 giờ. Đới với mợt sớ loại thực phẩm có chứa các chất có thể gây đợc hoặc ức chế sự tăng trưởng của Salmonella cần thực hiện qui trình tăng sinh đặc biệt như sau:
- Đới với mẫu gia cầm tươi sớng: đặt gia cầm vào mợt bao nhựa lớn, thêm vào 1 lít mơi trường tăng sinh BPW. Lắc bằng máy lắc khoảng 30 giây để mơi trường thấm được vào trong toàn bợ mẫu.
- Đới với mẫu sữa khơ: cho 25g mẫu vào trong túi PE vơ trùng, bở sung 225ml mơi trường BPW, để yên 60 phút ở nhiệt đợ phòng. Sau đó lắc cho đến khi sữa tan hoàn toàn.
- Đới với các loại gia vị hay các loại thực phẩm chứa nhiều gia vị: đờng nhất mẫu ở đợ pha loãng 1/100 trong BPW (thay vì 1/10 như bình thường) trước khi nuơi tăng sinh. Biện pháp này nhằm làm giảm nờng đợ các hợp chất ức chế sự tăng trưởng của Salmonella trong bước tăng sinh.
32
- Đới với các loại mẫu như casein, pho mat, bơ và các sản phẩm tương tự khác: thực hiện đờng nhất mẫu trong mơi trường tăng sinh đã được làm ẩm đến 40oC.
- Đới với sản phẩm chứa coca: đờng nhất mẫu trong mơi trường Skim Milk Broth được làm ẩm ở 40oC.
- Đới với dừa, các sản phẩm của dừa và các mẫu có hmà lượng chất béo cao: đờng nhất mẫu với BPW, sau đó thêm vào 2 - 3 giọt Triton X-100 trước khi ủ tăng sinh.
b) Bước tăng sinh chọn lọc
Lắc để trợn đều dung dịch tăng sinh, và chuyển 0,1ml sang 10ml mơi trường tăng sinh RV đã được ủ ấm đến 42oC. Ủ ở 42oC trong 18 - 24 giờ. Khi cần thiết cần kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ.
Mợt sớ mơi trường tăng sinh chọn lọc khác như Selenite Cysteine Broth, Tetrethionate Muller- Kauffman cũng được dùng. Mỡi loại mơi trường chỉ có tác dụng chọn lọc trên mợt đặc điểm phát triển của
Salmonella, mợt sớ dòng Salmonella trăng trưởng được trong mơi trường này nhưng lại khơng tăng trưởng được trong mơi trường khác.Do vậy, để tăng khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu thực phẩm cần phải dùng ít nhất 2 loại mơi trường tăng sinh chọn lọc khác nhau cho cùng mợt mẫu. Ngoài ra, mỡi mơi trường chọn lọc được ủ ở mợt nhiệt đợ nuơi cấy khác nhua như mơi trường RV được ủ ở 420C, mơi trường TT và SC được ủ ở 37oC trong 22 - 24 giờ.
c) Bước phân lập và nhận diện
Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giớng từ dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa mơi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella như XLD, HE, BS...Cường đợ chọn lọc và mức đợ
33
phân biệt thể hiện ở hình thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng mơi trường cũng khác nhau. Để chọn lọc và nhận dạng được tất cả các dòng Salmonella
phải dùng tới thiểu 2 mơi trường chọn lọc phân biệt khác nhau cho cùng mợt mẫu. Các biểu hiện của Salmonella trên từng mơi trường khác nhau như sau: - Mơi trường XLD: Khuẩn lạc có màu hờng trong suớt, có hay khơng có tâm đen. Mợt sớ dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.
- Mơi trường HE: khuẩn lạc có màu thay đởi từ xanh dương đến xanh lục, có hay khơng có tâm đen. Mợt sớ dòng Salmonella có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.
- Mơi trường BS: khuẩn lạc Salmonella có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kím tím. Mơi trường chung quanh khuẩn lạc chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển sang đen nếu kéo dài thời gian ủ.
- Mơi trường BPLS: có khuẩn lạc Salmonella màu hờng nhạt, trong suớt, xung quanh khuẩn lạc mơi trường chuyển sang màu đỏ.
- Mơi trường SS: Tất cả các đĩa mơi trường sau khi cấy được ủ ở 37oC trong 22-26 giờ. Sau khi ủ, chọn khuẩn lạc có đặc điểm của Salmonella như trên để thực hiện khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng nguyên.
d) Khẳng định
Từ mỡi mơi trường phân lập cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc đặc trưng qua mơi trường khơng chọn lọc như TSA. Ủ ở 37oC trong 18 - 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên mơi trường này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh.
34
Các thử nghiệm sinh hóa chính là: lên nem gloco, utea, manitol, indol, H2S, VP, ODC, LDC, saccharose, sorbitol. Các chủng Salmonella cho kết quả sau:
- Thử nghiệm H2S (KIA hay TSI) Salmonella chỉ lên men được dường gluco trong mơi trường trên vì thế phần nghiêng của mơi trường có màu đỏ, phần sâu vàng. Đa sớ các chủng Salmonella điều có khả năng sinh H2S nên có vạch màu đen trong mơi trường. Có thể quan sát thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch hoặc mơi trường bị đẩy lên.
- Thử nghiệm LDC (+): sau khi nuơi cấy, mơi trường bị kiềm hóa, khơng đởi màu (màu tím hay xanh).
- Thử nghiệm urea (-): Salmonella khơng phân giải urea nên khơng làm thay đởi ph của mơi trường nên mơi trường khơng đởi màu.
- Lên men manitol, sorbitol (+): mơi trường chuyển màu vàng vì bị acid hóa.
- Thử nghiệm Indol và VP (-).
- Các thử nghiệm kháng nguyên: cần được thực hiện song song với mẫu đới chứng bằng nước muới sinh lý để tránh hiện tượng ngưng kết giả. Hai loại huyế thanh đa giá cần dùng là Salmonella Polyvalent O và
Salmonella Polyvalent H. Phản ứng (+) khi chúng thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh nhưng khơng ngưng kết với nước muới sinh lý.
35
Bảng 1.4. Biểu hiện đặc trưng của Salmonella trong test sinh hĩa
Thử nghiệm Mơi trường Biểu hiện đặc trưng
H2S TSI/KIA Phần nghiêng đỏ, sâu vàng, nứt thạch và xuất hiện vạch đen
LDC LDC Khơng đởi màu
Urea Urea Khơng đở màu
Manitol,sorbitol Manitol, sorbitol Bị acid hĩa, mơi trường chuyển sang màu vàng
Indol Trypton Khơng xuất hiện vòng đỏ khi nhỏ thuớc thử Kovac’s
VP VP Khơng đởi màu khi nhỏ α – napthol 5% và KOH 40%
1.3.1.3. Báo cáo kết quả
Qui trình kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích định tính
Salmonella, giúp kết luận có hay khơng có Salmonella hiện diện trong 25g mẫu, khơng cho phép phân biệt được các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu. Để khẳng định được tên chủng Salmonella phân lập được cần phải tiến hành thử nghiệm ngưng kết với các loại kháng huyết thanh đơn giá khác nhau hay cần gửi các chủng Salmonella phân lập được đến các phòng thí nghiệm chuyên định danh vi sinh vật.
Cần lưu ý Salmonella là nhóm chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm. Do vậy cần tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Salmonella dùng làm đới chứng (+) cũng như khi thao tác trên các chủng phân lập được. Các mơi trường hay mẫu vật sau khi nuơi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa.
36
1.3.2. Phương pháp hiện đại
Bên cạnh những kỹ thuật sinh học phân tử cơ bản để phát hiện và định danh Salmonella, còn có những phương pháp khác, như: phương pháp miễn dịch (huyết thanh học, kỹ thuật ELISA, Western blot). Và đơi khi để tăng hiệu quả, đợ tin cậy cho xét nghiệm người ta đã kết hợp nhiều phương pháp với nhau, ví dụ: IMS-PCR assay (Immunomagnetic Separation and Polymerase Chain Reaction) để phát hiện Salmonella trong thực phẩm.
1.3.2.1. Phương pháp PCR
Phương pháp PCR là phương pháp tởng hợp DNA in vitro dựa trên khuơn là mợt trình từ DNA đích ban đầu, sau đó trình tự này được khuếch đại và nhân lên thành hàng triệu bản sao.
Mợt phản ứng PCR để cĩ thể thực hiện được phải cĩ: - DNA mẫu.
- Cặp mời (primers): mời xuơi và mời ngược. - Taq polymerase
- dNTP’s ( các nucleotide tự do)
Phản ứng PCR gờm nhiều chu kỳ lặp lại nới tiếp nhau. Mỡi chu kỳ là mợt quá trình gờm ba bước:
- Bước 1 (biến tính, denaturation): hỡn hợp được gia nhiệt lên đến 94 – 95oC. Mục đích của giai đoạn này là làm cho DNA mạch đơi tách ra thành hai mạch đơn.
- Bước 2 (bắt cặp): ở giai đoạn này nhiệt đợ hạ xuớng khoảng 55 – 65oC. giai đoạn này, các primer sẽ bắt cặp với trình tự thích hợp.
37
- Bước 3 (kéo dài): nhiệt đợ ở giai đoạn này được nâng lên 72oC, đây là nhiệt đợ thích hợp cho sự hoạt đợng của Taq polymerase trong quá trình tởng hợp DNA.
Trong phản ứng PCR, mợt chu kỳ gờm ba bước sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, sau mỡi chu kỳ thì sớ lượng DNA mẫu lại tăng lên gấp đơi. Sau khi thực hiện xong phản ứng PCR, đem sản phẩm DNA điện di trên gel agarose và nhuợm với ethydium bromide, sau đó quan sát dưới tia UV.
1.3.2.2. Phương pháp ELISA
Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là dực trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên. Tín hiệu của phản ứng kết hợp này được nhận biết thơng qua sự phát quang.
Trong sớ các phương pháp miễn dịch thì phương pháp hấp thụ miễm dịch sử dụng enzyme (Enzyme Link ImmunoSorbent Assy – ELISA ) là phương pháp được sử dụng phở biến nhất vì phương pháp này đơn giản và cho hiệu quả khá cao. Nguyên tắc của phương pháp ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng để bắt các kháng nguyên mục tiêu. Các kháng nguyên mục tiêu được pháp hiện nhờ mợt kháng thể thứ hai cĩ gắn với enzyme. Sau đó, bở sung mợt cơ chất đặc hiệu của enzyme, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra sản phẩm cĩ màu hay phát quang. Bằng cách theo dõi sự thay đởi màu, cĩ thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên.
ELISA hiện nay đã được sử dụng rợng rãi dưới dạng bợ các bợ kit thương mại (như kit phát hiện Salmonella, Escherichia coli, Listeria…).
1.3.2.3.Phương pháp màng PETRI (Petrifilms)
Mơi trường dinh dưỡng ở dạng đơng khơ, được cớ định vào màng mỏng gọi là Petrifilm. Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ bên trên được nâng lên và nhỏ vào đo 1ml dịch mẫu rời đậy lại. Mợt đĩa petri nhựa được đặt lên
38
màng bảo vệ để tạo mợt khuơn tròn. Mơi trường dinh dưỡng sẽ hở trợ cho sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian ủ. Cĩ thể đếm trực tiếp khuẩn lạc trên Petrifilm.
Petrifilm được sử dụng để kiểm tra tởng sớ vi sinh vật hiếu khí, coliform, feacal coliform, tởng sớ nấm men, nấm mớc. Ưu điểm của kỹ thuật Petrifilm là dễ thao tác, tiết kiệm thời gian ủ và bảo quản. Thời gian sử dụng lâu là do mơi trường ở dạng đơng khơ và khơng cần xử lý nhiệt như mơi trường thơng thường. cĩ thể sử dụng nước cất vơ trùng để làm ướt mơi trường đơng khơ. Sau khi mơi trường đơng lại, cĩ thể dùng trực tiếp Petrifilm để đếm tạp khuẩn trên bề mặt.
39
CHƯƠNG 2:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
40
2.1. Vật liệu 2.1.1. Mẫu 2.1.1. Mẫu
Tiến hành lấy mẫu ở các chợ và các siêu thị, chủ yếu là các loại sản phẩm đơng lạnh như: tơm, mực..
2.1.2. Mơi trường, hóa chất và dụng cụ 2.1.2.1. Mơi trường và hóa chất 2.1.2.1. Mơi trường và hóa chất
- Mơi trường canh RV (Rappaport Vassiliadis Soya Pepton)
- Mơi trường pha loãng mẫu BPW(Buffered Peptone Water) - Mơi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar) - Mơi trường TSA (Tryptone Soya Agar)
- Mơi trường TSI (Triple Sugar Iron Agar)
- Mơi trường TT (Tetrethionate Muller – Kauffmanm)
- Mơi trường HE (Hektoen Entric Agar) - Mơi trường BS (Bismuth Sulphite Agar)
- Brillian Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS) - Canh LDC (Lysine Decarboxylase)
- Ornithine Decarboxylase - Mơi trường MR-VP Broth - Mơi trường Urea Broth
- Mơi trường Mannitol Phenol Red Broth base) - Sucrose
- Sorbitol - Canh Tryptone - Thuớc thử Kovac’s - Thuớc thử Barritt
41
- Cờn 70 % và cờn 96 % - Nước cất
2.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị a) Dụng cụ a) Dụng cụ
- Ống nghiệm có nắp
- Đĩa petri vơ trùng - Pipette
- Cân điện tử - Bình tam giác - Cóc thủy tinh - Kéo
- Đũa khuấy
- Túi nylon vơ trùng - Đèn cờn
- Que cấy vòng - Que cấy thẳng
- Bình chứa mơi trường
b) Thiết bị
- Autoclave - Tủ lạnh - Bếp từ
- Bể điều nhiệt 42oC - Tủ ấm 37oC
- Tủ cấy - Bếp đun - Bể ởn nhiệt
42
2.2. Phương pháp thực hiện
2.2.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu a) Lấy mẫu a) Lấy mẫu
Chuẩn bị đầy đủ các dụng cụ lấy mẫu khi đi lấy mẫu về phân tích. Chọn mợt địa điểm sạch, trớng và an toàn đặt thùng lấy mẫu xuớng. Tiến hành lấy mẫu.
Phải lấy mẫu ở tất cả các vị trí. Khi lấy mẫu cho vào túi PE, tránh khơng để tay chạm vào miệng túi và tránh khơng để mẫu dính lên miệng túi dễ gây nhiễm mẫu và kết quả sẽ khơng chính xác. Khơng được lấy quá ít mẫu, tới thiểu phải là 200g.
Sau khi lấy mẫu, hàn miệng túi PE lại, dùng bút ghi rõ tên sản phẩm, nhà sản xuất, ngày sản xuất lên túi mẫu.
Cất mẫu vào thùng đựng mẫu, cho dụng cụ vào mợt túi PE khác và khơng dùng lại dụng cụ này.
Sau khi lấy mẫu xong, cho tấc cả các túi mẫu vào thùng giữ nhiệt và đậy kín lại sau đó đem đến nơi phân tích mẫu.
b) Bảo quản mẫu
Mẫu sau khi lấy xong, nếu khơng phân tích ngay, cho vào ngăn đá tủ lạnh bảo quản mẫu. Chú ý mẫu phải được phân tích trong vòng 24h từ khi lấy.
2.2.2. Chuẩn bị mẫu
Rã đơng trước khi phân tích, rã ở nhiệt đợ phòng.
Cân mẫu:các dụng cụ lấy mẫu cân, đựng mẫu phân tích và nơi cân cần đảm bảo vơ trùng. Lượng mẫu cần cân tùy theo loại vi sinh cần phân tích.
43
2.2.3. Phương pháp
Định tính Salmonella bằng phương pháp trải đĩa và test sinh hóa. Đây là phương pháp dùng để định tính và kết luận phát hiện hay khơng phát hiện Salmonella trong mợt lượng mẫu xác định.
Cấy mẫu vào mơi trường tăng sinh chọn lọc RV, phân lập trên mơi