Dùng que cấy vòng thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giớng từ dịch tăng sinh chọn lọc lên đĩa mơi trường chọn lọc phân biệt đặc trưng cho Salmonella như XLD, HE, BS...Cường đợ chọn lọc và mức đợ
33
phân biệt thể hiện ở hình thái khuẩn lạc của Salmonella trên từng mơi trường cũng khác nhau. Để chọn lọc và nhận dạng được tất cả các dòng Salmonella
phải dùng tới thiểu 2 mơi trường chọn lọc phân biệt khác nhau cho cùng mợt mẫu. Các biểu hiện của Salmonella trên từng mơi trường khác nhau như sau: - Mơi trường XLD: Khuẩn lạc có màu hờng trong suớt, có hay khơng có tâm đen. Mợt sớ dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.
- Mơi trường HE: khuẩn lạc có màu thay đởi từ xanh dương đến xanh lục, có hay khơng có tâm đen. Mợt sớ dòng Salmonella có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần hết khuẩn lạc.
- Mơi trường BS: khuẩn lạc Salmonella có màu nâu xám hay màu đen, thỉnh thoảng có xuất hiện ánh kím tím. Mơi trường chung quanh khuẩn lạc chuyển thành màu nâu và sau đó chuyển sang đen nếu kéo dài thời gian ủ.
- Mơi trường BPLS: có khuẩn lạc Salmonella màu hờng nhạt, trong suớt, xung quanh khuẩn lạc mơi trường chuyển sang màu đỏ.
- Mơi trường SS: Tất cả các đĩa mơi trường sau khi cấy được ủ ở 37oC trong 22-26 giờ. Sau khi ủ, chọn khuẩn lạc có đặc điểm của Salmonella như trên để thực hiện khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm kháng nguyên.
d) Khẳng định
Từ mỡi mơi trường phân lập cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc đặc trưng qua mơi trường khơng chọn lọc như TSA. Ủ ở 37oC trong 18 - 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên mơi trường này được sử dụng cho các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh.
34
Các thử nghiệm sinh hóa chính là: lên nem gloco, utea, manitol, indol, H2S, VP, ODC, LDC, saccharose, sorbitol. Các chủng Salmonella cho kết quả sau:
- Thử nghiệm H2S (KIA hay TSI) Salmonella chỉ lên men được dường gluco trong mơi trường trên vì thế phần nghiêng của mơi trường có màu đỏ, phần sâu vàng. Đa sớ các chủng Salmonella điều có khả năng sinh H2S nên có vạch màu đen trong mơi trường. Có thể quan sát thấy hiện tượng sinh hơi qua hiện tượng làm vỡ thạch hoặc mơi trường bị đẩy lên.
- Thử nghiệm LDC (+): sau khi nuơi cấy, mơi trường bị kiềm hóa, khơng đởi màu (màu tím hay xanh).
- Thử nghiệm urea (-): Salmonella khơng phân giải urea nên khơng làm thay đởi ph của mơi trường nên mơi trường khơng đởi màu.
- Lên men manitol, sorbitol (+): mơi trường chuyển màu vàng vì bị acid hóa.
- Thử nghiệm Indol và VP (-).
- Các thử nghiệm kháng nguyên: cần được thực hiện song song với mẫu đới chứng bằng nước muới sinh lý để tránh hiện tượng ngưng kết giả. Hai loại huyế thanh đa giá cần dùng là Salmonella Polyvalent O và
Salmonella Polyvalent H. Phản ứng (+) khi chúng thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh nhưng khơng ngưng kết với nước muới sinh lý.
35
Bảng 1.4. Biểu hiện đặc trưng của Salmonella trong test sinh hĩa
Thử nghiệm Mơi trường Biểu hiện đặc trưng
H2S TSI/KIA Phần nghiêng đỏ, sâu vàng, nứt thạch và xuất hiện vạch đen
LDC LDC Khơng đởi màu
Urea Urea Khơng đở màu
Manitol,sorbitol Manitol, sorbitol Bị acid hĩa, mơi trường chuyển sang màu vàng
Indol Trypton Khơng xuất hiện vòng đỏ khi nhỏ thuớc thử Kovac’s
VP VP Khơng đởi màu khi nhỏ α – napthol 5% và KOH 40%
1.3.1.3. Báo cáo kết quả
Qui trình kiểm nghiệm này chỉ cho phép phân tích định tính
Salmonella, giúp kết luận có hay khơng có Salmonella hiện diện trong 25g mẫu, khơng cho phép phân biệt được các dòng Salmonella hiện diện trong mẫu. Để khẳng định được tên chủng Salmonella phân lập được cần phải tiến hành thử nghiệm ngưng kết với các loại kháng huyết thanh đơn giá khác nhau hay cần gửi các chủng Salmonella phân lập được đến các phòng thí nghiệm chuyên định danh vi sinh vật.
Cần lưu ý Salmonella là nhóm chứa các dòng gây bệnh nguy hiểm. Do vậy cần tuân thủ triệt để các biện pháp an toàn khi làm việc với các chủng Salmonella dùng làm đới chứng (+) cũng như khi thao tác trên các chủng phân lập được. Các mơi trường hay mẫu vật sau khi nuơi cấy cần phải hấp khử trùng cẩn thận trước khi rửa.
36
1.3.2. Phương pháp hiện đại
Bên cạnh những kỹ thuật sinh học phân tử cơ bản để phát hiện và định danh Salmonella, còn có những phương pháp khác, như: phương pháp miễn dịch (huyết thanh học, kỹ thuật ELISA, Western blot). Và đơi khi để tăng hiệu quả, đợ tin cậy cho xét nghiệm người ta đã kết hợp nhiều phương pháp với nhau, ví dụ: IMS-PCR assay (Immunomagnetic Separation and Polymerase Chain Reaction) để phát hiện Salmonella trong thực phẩm.
1.3.2.1. Phương pháp PCR
Phương pháp PCR là phương pháp tởng hợp DNA in vitro dựa trên khuơn là mợt trình từ DNA đích ban đầu, sau đó trình tự này được khuếch đại và nhân lên thành hàng triệu bản sao.
Mợt phản ứng PCR để cĩ thể thực hiện được phải cĩ: - DNA mẫu.
- Cặp mời (primers): mời xuơi và mời ngược. - Taq polymerase
- dNTP’s ( các nucleotide tự do)
Phản ứng PCR gờm nhiều chu kỳ lặp lại nới tiếp nhau. Mỡi chu kỳ là mợt quá trình gờm ba bước:
- Bước 1 (biến tính, denaturation): hỡn hợp được gia nhiệt lên đến 94 – 95oC. Mục đích của giai đoạn này là làm cho DNA mạch đơi tách ra thành hai mạch đơn.
- Bước 2 (bắt cặp): ở giai đoạn này nhiệt đợ hạ xuớng khoảng 55 – 65oC. giai đoạn này, các primer sẽ bắt cặp với trình tự thích hợp.
37
- Bước 3 (kéo dài): nhiệt đợ ở giai đoạn này được nâng lên 72oC, đây là nhiệt đợ thích hợp cho sự hoạt đợng của Taq polymerase trong quá trình tởng hợp DNA.
Trong phản ứng PCR, mợt chu kỳ gờm ba bước sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, sau mỡi chu kỳ thì sớ lượng DNA mẫu lại tăng lên gấp đơi. Sau khi thực hiện xong phản ứng PCR, đem sản phẩm DNA điện di trên gel agarose và nhuợm với ethydium bromide, sau đó quan sát dưới tia UV.
1.3.2.2. Phương pháp ELISA
Nguyên tắc của phương pháp miễn dịch là dực trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên. Tín hiệu của phản ứng kết hợp này được nhận biết thơng qua sự phát quang.
Trong sớ các phương pháp miễn dịch thì phương pháp hấp thụ miễm dịch sử dụng enzyme (Enzyme Link ImmunoSorbent Assy – ELISA ) là phương pháp được sử dụng phở biến nhất vì phương pháp này đơn giản và cho hiệu quả khá cao. Nguyên tắc của phương pháp ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng để bắt các kháng nguyên mục tiêu. Các kháng nguyên mục tiêu được pháp hiện nhờ mợt kháng thể thứ hai cĩ gắn với enzyme. Sau đó, bở sung mợt cơ chất đặc hiệu của enzyme, enzyme sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra sản phẩm cĩ màu hay phát quang. Bằng cách theo dõi sự thay đởi màu, cĩ thể phát hiện sự hiện diện và định lượng kháng nguyên.
ELISA hiện nay đã được sử dụng rợng rãi dưới dạng bợ các bợ kit thương mại (như kit phát hiện Salmonella, Escherichia coli, Listeria…).
1.3.2.3.Phương pháp màng PETRI (Petrifilms)
Mơi trường dinh dưỡng ở dạng đơng khơ, được cớ định vào màng mỏng gọi là Petrifilm. Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ bên trên được nâng lên và nhỏ vào đo 1ml dịch mẫu rời đậy lại. Mợt đĩa petri nhựa được đặt lên
38
màng bảo vệ để tạo mợt khuơn tròn. Mơi trường dinh dưỡng sẽ hở trợ cho sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian ủ. Cĩ thể đếm trực tiếp khuẩn lạc trên Petrifilm.
Petrifilm được sử dụng để kiểm tra tởng sớ vi sinh vật hiếu khí, coliform, feacal coliform, tởng sớ nấm men, nấm mớc. Ưu điểm của kỹ thuật Petrifilm là dễ thao tác, tiết kiệm thời gian ủ và bảo quản. Thời gian sử dụng lâu là do mơi trường ở dạng đơng khơ và khơng cần xử lý nhiệt như mơi trường thơng thường. cĩ thể sử dụng nước cất vơ trùng để làm ướt mơi trường đơng khơ. Sau khi mơi trường đơng lại, cĩ thể dùng trực tiếp Petrifilm để đếm tạp khuẩn trên bề mặt.
39
CHƯƠNG 2:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
40
2.1. Vật liệu 2.1.1. Mẫu 2.1.1. Mẫu
Tiến hành lấy mẫu ở các chợ và các siêu thị, chủ yếu là các loại sản phẩm đơng lạnh như: tơm, mực..
2.1.2. Mơi trường, hóa chất và dụng cụ 2.1.2.1. Mơi trường và hóa chất 2.1.2.1. Mơi trường và hóa chất
- Mơi trường canh RV (Rappaport Vassiliadis Soya Pepton)
- Mơi trường pha loãng mẫu BPW(Buffered Peptone Water) - Mơi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar) - Mơi trường TSA (Tryptone Soya Agar)
- Mơi trường TSI (Triple Sugar Iron Agar)
- Mơi trường TT (Tetrethionate Muller – Kauffmanm)
- Mơi trường HE (Hektoen Entric Agar) - Mơi trường BS (Bismuth Sulphite Agar)
- Brillian Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS) - Canh LDC (Lysine Decarboxylase)
- Ornithine Decarboxylase - Mơi trường MR-VP Broth - Mơi trường Urea Broth
- Mơi trường Mannitol Phenol Red Broth base) - Sucrose
- Sorbitol - Canh Tryptone - Thuớc thử Kovac’s - Thuớc thử Barritt
41
- Cờn 70 % và cờn 96 % - Nước cất
2.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị a) Dụng cụ a) Dụng cụ
- Ống nghiệm có nắp
- Đĩa petri vơ trùng - Pipette
- Cân điện tử - Bình tam giác - Cóc thủy tinh - Kéo
- Đũa khuấy
- Túi nylon vơ trùng - Đèn cờn
- Que cấy vòng - Que cấy thẳng
- Bình chứa mơi trường
b) Thiết bị
- Autoclave - Tủ lạnh - Bếp từ
- Bể điều nhiệt 42oC - Tủ ấm 37oC
- Tủ cấy - Bếp đun - Bể ởn nhiệt
42
2.2. Phương pháp thực hiện
2.2.1. Lấy mẫu và bảo quản mẫu a) Lấy mẫu a) Lấy mẫu
Chuẩn bị đầy đủ các dụng cụ lấy mẫu khi đi lấy mẫu về phân tích. Chọn mợt địa điểm sạch, trớng và an toàn đặt thùng lấy mẫu xuớng. Tiến hành lấy mẫu.
Phải lấy mẫu ở tất cả các vị trí. Khi lấy mẫu cho vào túi PE, tránh khơng để tay chạm vào miệng túi và tránh khơng để mẫu dính lên miệng túi dễ gây nhiễm mẫu và kết quả sẽ khơng chính xác. Khơng được lấy quá ít mẫu, tới thiểu phải là 200g.
Sau khi lấy mẫu, hàn miệng túi PE lại, dùng bút ghi rõ tên sản phẩm, nhà sản xuất, ngày sản xuất lên túi mẫu.
Cất mẫu vào thùng đựng mẫu, cho dụng cụ vào mợt túi PE khác và khơng dùng lại dụng cụ này.
Sau khi lấy mẫu xong, cho tấc cả các túi mẫu vào thùng giữ nhiệt và đậy kín lại sau đó đem đến nơi phân tích mẫu.
b) Bảo quản mẫu
Mẫu sau khi lấy xong, nếu khơng phân tích ngay, cho vào ngăn đá tủ lạnh bảo quản mẫu. Chú ý mẫu phải được phân tích trong vòng 24h từ khi lấy.
2.2.2. Chuẩn bị mẫu
Rã đơng trước khi phân tích, rã ở nhiệt đợ phòng.
Cân mẫu:các dụng cụ lấy mẫu cân, đựng mẫu phân tích và nơi cân cần đảm bảo vơ trùng. Lượng mẫu cần cân tùy theo loại vi sinh cần phân tích.
43
2.2.3. Phương pháp
Định tính Salmonella bằng phương pháp trải đĩa và test sinh hóa. Đây là phương pháp dùng để định tính và kết luận phát hiện hay khơng phát hiện Salmonella trong mợt lượng mẫu xác định.
Cấy mẫu vào mơi trường tăng sinh chọn lọc RV, phân lập trên mơi trường XLD và khẳng định bằng các mơi trường thử nghiệm sinh hoá (mơi trường TSI, Ure Broth, lên men Mannitol, LDC both, thử nghiệm Indol, thử nghiệm Voges- Proskauer).
44
2.2.4. Qui trình thu thập mẫu và tiến hành kiểm nghiệm Salmonella
Hình 2.1. Qui trình thu thập mẫu và tiến hành kiểm nghiệm Salmonella.
Sản phẩm thủy sản
Thu tại các chợ và siêu thị
Đánh giá các chỉ tiêu
Cảm quan Vi sinh
Test Salmonella
45
2.2.5. Qui trình phân tích
Hình 2.2. Qui trình phân tích phát hiện Salmonella
Cấy 0,1ml dung dịch tăng sinh sang mơi trường tăng sinh chọn lọc (RV), ủ ở 42oC, 18 - 24 giờ.
Phân lập khuẩn lạc đơn trên ít nhất 2 mơi trường chọn lọc phân biệt (XLD,HE,BS,SS...),ủ ở 37oC, 24 giờ.
Chọn các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella, cấy sang BHI hay TSA, ủ qua đêm.
Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:
- Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/khơng H2S, sinh hơi/khơng.
- Urea:(-), indol: (-), VP: (-), LDC: (+), ODC: (+), Manitol: (+), Sobitol: (+).
Thử nghiệm ngưng kết kháng nguyên huyết thanh: Poly: O, Poly: H.
Kết luận: Salmonella dương tính/ âm tính trong 25g mẫu.
Đờng nhất 25g mẫu trong 225ml mơi trường tăng sinh (BPW), ủ ở 37oC, 18 - 24 giờ.
46
2.2.5.1 Thuyết minh qui trình a) Chuẩn bị mẫu a) Chuẩn bị mẫu
Dùng kéo vơ khuẩn cắt 25g mẫu (khơng lấy mỡ, lấy cả chất lỏng nếu cĩ), cho vào bao nylon vơ khuẩn. Thêm vào 225ml mơi trường PBW đã hấp khử trùng để nguợi. Tiến hành đờng nhất mẫu được đợ pha lỗng 10-1. Đem ủ ở nhiệt đợ 37oC trong 24 giờ.
b) Cấy mẫu
Tăng sinh: Cấy 0,1ml dịch mẫu cĩ nờng đợ 10-1 vào ớng nghiệm cĩ chứa 10ml mơi trường tăng sinh chọn lọc RV, Ủ ở 42 ± 0,5 oC trong 24 giờ.
Phân lập: Cấy mẫu từ mơi trường RV sang mơi trường thạch đĩa
XLD và ủ ở nhiệt đợ 37oC trong 24 giờ. Nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng của
salmonella trên mơi trường XLD: trịn, lời, trong suớt , có tâm đen đơi khi tâm đen quá lớn bao trùm cả khuẩn lạc, mơi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ (hờng)…
Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang mơi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh khơng chọn lọc và ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ
c) Thử nghiệm khẳng định
Lấy khuẩn lạc từ mơi trường TSA cấy sang các mơi trường thử nghiệm sinh hóa. Thực hiện như sau:
Thử nghiệm trên mơi trường TSI
Hấp khử trùng mơi trường TSI ở 121oC trong 15 phút và phân phới mơi trường vào các ớng vơ trùng để làm ớng thạch nghiêng.
Dùng que cấy vòng cấy sinh khới từ khuẩn lạc của giớng thuần sâu vào đáy của ớng thạch nghiêng.
47
Thử nghiệm Urea Broth
Cấy vi sinh vật đã được phân lập vào mơi trường canh urea có chứa chất chỉ thị là bromocresol purple
Ủ ở 37oC trong khoảng 12h – 18h.
Thử nghiệm (+): Mơi trường chuyển sang màu vàng. Thử nghiệm (-): Mơi trường khơng đởi màu.
Lên men mannitol
Mơi trường sử dụng là mơi trường phenol red broth base có pH 7.4, chỉ thị mơi trường này là phenol red có màu đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH < 6.8.
Tiến hành cấy vào các ớng mơi trường các chủng vi sinh vật cần khẳng định.
Ủ 37oC trong 18 – 24h.
Khả năng lên men của chúng được đánh giá dựa vào sự sinh hơi và sinh acid.
Sinh acid (+): Mơi trường màu cam chuyển sang vàng. Sinh hơi (-): Có bọt khí trong ớng Durnham.
Thử nghiệm LDC
Sử dụng mơi trường Falkow.
Tiến hành cấy vào các ớng mơi trường các chủng vi sinh vật cần khẳng định.
Chất chỉ thị màu trong mơi trường là Bromocresol purple.
- Phản ứng (+): mơi trường giữ nguyên màu tím ban đầu, canh khuẩn đục.
48
Thử nghiệm khả năng sinh Indol
Cấy VSV thử nghiệm qua mơi trường canh trypton ủ khoảng 24 giờ ở 37oC.
Nhỏ vài giọt ether để kéo indol lên bề mặt mơi trường, thêm vài giọt thuớc thử Kovac’s
Quan sát sau vài phút.
- Thử nghiệm (+): trên bề mặt mơi trường xuất hiện vòng màu đỏ cánh sen.
- Thử nghiệm (-): khơng xuất hiện vòng đỏ.
Thử nghiệm Voges – Proskauer
Cấy vi sinh vật vào trong mơi trường glucose phosphate (MR-VP Broth).
Ủ ở nhiệt đợ 37oC trong vòng từ 2 - 5 ngày.
Thêm vào canh khuẩn dung dịch thuớc thử anpha- naphtol 5% trong cờn và dung dịch KOH 40% hay NaOH 40 %. với tỷ lệ 3:1.