Đĩa thạch sau khi được trải vi khuẩn và bổ sung 20 µl dịch lectin nồng độ 10,82 mg/ml vào giấy, sẽ được ủ ở 370C trong 24 giờ. Hoạt độ kháng khuẩn của lectin từ lá tỏi được tính bằng mm đường kính vòng vô khuẩn trên đĩa thạch.
Kết quả được trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.10.
Bảng 3.7: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng một số vi khuẩn của lectin từ lá tỏi Kí
hiệu
Vi khuẩn Đặc điểm vi khuẩn Đường kính vòng
vô khuẩn (mm)
EC Escherichia Coli
Gam (-), hình que.
Gây bệnh viêm nhiễm đường ruột ở người
-
T12 Vibrio harveye
Gam (-), hình que.
Gây bệnh cho động vật biển sò, cá đặc biệt là tôm .
-
SA Staphylococcus aureus
Gam (+)
Gây bệnh viêm nhiễm da ở người -
BC Bacillus cereus Gam (+), hình que.
Gây ngộ độc thực phẩm [48]. -
SF Streptococcus faecalis
Gam (+)
PA Pseudomonas aeruginosa
Gam (-), hình que.
Gây viêm nhiễm ở người và độc vật, kháng kháng sinh .
-
T5 Enterobacter cloace
Gam (-).
Gây viêm đường tiết niệu, nhiễm trùng đường hô hấp [15].
12
Chú thích: “-“: Đường kính vòng kháng khuẩn bằng 0
(a) Enterobacter cloace (T5)
(b) Streptococcus faecalis (SF)
Hình 3.10: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng một số vi khuẩn của lectin từ lá tỏi. 12
Kết quả từ bảng 3.7 cho thấy, lectin từ lá tỏi có khả năng kháng lại 1/7 loài vi khuẩn gây bệnh đường kính vòng vô khuẩn là 12 mm. Từ hình 3.9 nhận thấy rõ sự khác biệt của việc kháng hay không kháng vi khuẩn: mẫu đối chứng bằng dung dịch
đệm PBS cho kết quả âm tính với cả hai mẫu vi khuẩn Enterobacter cloace (T5) và
Streptococcus faecalis (SF), có nghĩa khả năng kháng khuẩn là do chính lectin từ lá
tỏi gây nên (nếu có); mẫu đối chứng bằng ampicillin cũng là một minh họa cụ thể,
tại thử nghiệm kháng vi khuẩn T5, lectin từ lá tỏi và ampicillin đều cho kết quả dương tính với đường kính vòng vô khuẩn là 12 mm, tức là khả năng kháng T5 của
chúng là như nhau.
Ngoài ra, dựa vào kết quả từ bảng 3.7 vẫn chưa thể kết luận: lectin từ lá tỏi không có khả năng kháng với 6/7 loài vi khuẩn. Vì, mẫu lectin từ lá tỏi dùng trong nghiên cứu này có nồng độ % lectin thấp do bị pha loãng sau quá trình thẩm tách. Nên, để đảm bảo đưa ra kết luận chính xác thì cần nghiên cứu tăng nồng độ % lectin bằng phương pháp ultraftli trước khi tiến hành thử nghiệm kháng khuẩn.
Các loại vi khuẩn trên được biết đến như là những tác nhân gây ra những căn bệnh nguy hiểm cho người và động vật như: gây viêm nhiễm, gây ngộ độc …Mặt khác, có mầm bệnh đã kháng rất nhiều kháng sinh thông dụng, vì vậy việc chữa trị và loại bỏ chúng ngày càng gặp nhiều khó khăn và tốn kém [13], [48]. Do đó, khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh của lectin từ lá tỏi sẽ là một trong những phát triển quan trọng nhằm định hướng sử dụng lectin như là một công cụ hữu hiệu trong tương lai. Và để có thể phát triển rộng hơn về định hướng này, cần thử nghiệm thêm khả năng kháng khuẩn với nhiều chủng loại vi khuẩn hơn.
Tóm lại, qua kết quả nghiên cứu của đồ án cho thấy tính chất hóa lý và sinh học của lectin sẽ là những tiền đề quan trọng và thuận lợi bước đầu để tiếp tục nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, chẳng hạn lĩnh vực y sinh, nông nghiệp.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu được qua quá trình nghiên cứu đã rút ra kết luận cho quy trình thu nhận và khảo sát tính chất hóa lý và đặc tính sinh học của lectin chiết
từ lá tỏi (Allium sativum L.) như sau:
Đã tìm được các điều kiện thích hợp để chiết lectin từ lá tỏi:
+ Dung môi chiết: dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85% NaCl) pH= 7,4.
+ Nhiệt độ chiết: nhiệt độ phòng.
+ Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi chiết (w/v): 1: 6. + Thời gian chiết : 8 giờ.
Bằng phương pháp kết tủa protein lectin bằng muối amoni sunfate nồng độ 50% để sau 6 giờ ở nhiệt độ 150C, thu được chế phẩm lectin kỹ thuật có hoạt độ NKHC là 29, hoạt độ riêng là 47,32 HU/mg và hoạt độ tổng số là 3584 HU, nồng độ protein nhỏ nhất gây NKHC là 21,13 µg.ml-1.
Đã xác định được một số tính chất hóa lý của lectin từ lá tỏi (Allium
sativum L.):
+ Lectin có khả năng bền nhiệt, khoảng nhiệt độ hoạt động từ 20- 600C và ổn định ở vùng nhiệt độ từ 20- 500C (duy trì 100% hoạt tính sau 30 phút phản ứng).
+ Hoạt tính NKHC không thay đổi ở vùng pH 6- 8, giảm 50% ở pH 3- 5 và pH 9- 10.
+ Không bị mất hoạt tính khi có mặt của EDTA với nồng độ 50 mM.
Bước đầu xác định đặc tính sinh học của lectin từ lá tỏi (Allium
sativum L.)
+ Lectin không có khả năng liên kết với tất cả cá loại đường trong thí nghiệm, chỉ liên kết với 2/5 loại glycoprotein ở nồng độ khac nhau là: Yeast mannan, Bovine thryroglobulin.
2. KIẾN NGHỊ
Để hoàn thiện hơn quá trình tinh sạch và đảm bảo tính thuyết phục của kết
quả thu được, chúng tôi có những kiến nghị sau đây:
1. Tiến hành xác định khối lượng phân tử lectin từ lá tỏi ta bằng phương pháp sắc ký lọc gel.
2. Tiến hành cô đặc dịch sau thẩm tích bằng phương pháp ultraftli.
3. Tiến hành mở rộng xác định khả năng liên kết với nhiều loại đường và glycoprotein khác nhau.
4. Tiến hành mở rộng xác định khả năng kháng khuẩn với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh khác nhau
5. Hoàn thiện quy trình thu chế phẩm lectin từ lá tỏi ta ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot.
6. Nguyên cứu điều kiện bảo quản chế phẩm.
7. Ứng dụng chế phẩm lectin trong một số lĩnh vực như y dược hoặc nông nghiệp
Ngoài ra, có thể tiến hành thử nghiệm nghiên cứu tách chiết và xác định đặc tính hóa lý và sinh học của lectin từ các loại thực vật một lá mầm khác để có thể ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Trương Văn Châu (2004), “Một số tính chất háo sinh của Lectin mít na”, tạp
chí khoa học ĐHSP Hà Nội, 4, pp. 83-87.
2. Võ Văn Chi (2003), Tự điển thực vật thông dụng- Tập I, Nhà xuất bản khoa
học kỹ thuật.
3. Phan Thị Việt Hà (2011), Nghiên cứu chiết tách, khảo sát tính chất của
lectin từ hạt đậu đỏ tây (phaseolus vulgaris), Luận Văn Thạc sĩ kỹ thuật, Đại
Học Đà Nẵng, Đà Nẵng.
4. Đỗ Ngọc Liên, Trần Tuấn Quỳnh (1991), “Tách tinh chế và một số tính chất
của lectin từ hạt chay A. tonkinensis”, Tạp chí khoa học, 13(2), pp. 20- 27.
5. Trần Thị Long, Nguyễn Quốc Khang (1996), “Tinh sạch và một vài đặc
trưng của lectin từ hạt chay Artocarpus tonkinensis”, tạp chí khoa học
ĐHQG Hà Nội, 12, pp. 15- 19.
6. Lê Thanh Mai và các cộng sự (2006), Các phương pháp phân tích ngành
công nghệ lên men, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 332 trang.
7. Nguyễn Thị Thịnh, Lê Doãn Diên, Nguyễn Quốc Khang và Phan Huy Bảo
(1983), “Kết quả điều tra lectin ở một số giống đậu ở Việt Nam”, Tạp chí
sinh học, 5(4), pp. 11-18.
8. Đặng Thị Thu, Tô Kim Anh, Lê Quang Hòa, Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Thị
Xuân Sâm, Lê Ngọc Tú, Đỗ Hoa Viên (2009), Cơ sở công nghệ sinh
học_Tập 2: Công nghệ hóa sinh, NXB Giáo dục Việt Nam, Đà Nẵng.
9. Võ Thị Diệu Trang (2011), Nghiên cứu thu nhận lectin từ rong đỏ
Kappaphycus striatum và khảo sát khả năng ứng dụng, Luận Văn Thạc sĩ kỹ
thuật, Đại Học Bách Khoa Hà Nội, Hà Nội.
10. Amin Sadeghi , Sylvia Broeders, Henri De Greve, Jean-Pierre Hernalsteens, Willy J Peumans, Els JM Van Damme and Guy Smagghe (2007), “Expression of garlic leaf lectin under thecontrol of the phloem-specific
promoter Asus1from Arabidopsis thaliana protects tobacco plants against the
tobacco aphid”, Pest Manag Sci, 63, pp. 1215–1223.
11.Andréa F.S. Santos, Luciana A. Luz, Adriana C.C. Argolo, Jose A. Teixeira, Patrıı´cia M.G. Paiva, Luana C.B.B. Coelho (2009), “Isolation of a
seed coagulant Moringa oleifera lectin”, Process Biochemistry, 44, pp. 504–
508.
12.Anna A. Powolny and Shivendra V. Singh (2008), “Multitargeted prevention
and therapy of cancer by diallyl trisulfide and related Allium vegetable- derived organosulfur compounds”, Cancer Lett., 269 (2), pp. 305- 314.
13.Austin B. and Zhang H. (2006), “Vibrio harceyi: a significant path gen ò marine vertebrates and invertebrates”, Letters in applied Microbiology, 43
(2), pp. 119- 214.
14.Balzarini (1991), “Alpha-(1- 3)- and alpha-(1- 6)- D- mannose- specific plant lectins are markedly inhibitory to human immunodeficiency virus and
cytomegalovirus infections in vitro “, Antimicrob Agents Chemother, 53 (3),
pp. 410 -6.
15.Barnes B. J., Wiederhold N.P,, Micek S.T., Polish L.B., Ritchie D.J. (2003),
“Enterobacter Cloacae ventriculitis successfully treated with cefepime and gentamicin: case report and review of the literature”, Pharmacotherapy,
23(4), pp. 537-42.
16.Barondes S. H., Cooper D. N., Gitt M.A., Lefler H. (1994), “Galectin:
Structure and function of a large family of animal lectin”, J. Biol. Chem.,
269, 20807-10.
17.Bhagyashree Joshi, Jayant M Khire, Hephzibah SivaRaman, M.Islam Khan (1997), “Purification and characterization of an extracellular lectin (Lectin I)
from Agrobacterium radiobacter NCIM 2443”, Biochimica et Biophysica
Acta (BBA) - General Subjects, 1336 (2), pp. 218–224.
18.Calvete J. J., Costa F. H. F., Saker S. S., Murciano M. P. M., Nagano C. S., Cavada B. S., Grangeiro T. B., Ramos M. V., Bloch C., Freitas B. T. and
Sampaio A. H. (2000), “The amino acid sequence of the agglutinin isolated
from the red marine alga Bryothamnion triquetrum defines a novel lectin structure”, CMLS. Cell Mol. Life Sci., 57, pp. 343- 350.
19.Clement F, Siddanakoppalu NP, Yeldur PV (2010), “Identity of the
immunomodulatory proteins from garlic (Allium sativum) with the major garlic lectins or agglutinins”, International Immunopharmacology, 10 (3),
pp. 316-324.
20.Cynthia O. Nascimento, Cynthia O. Nascimento, Paulo A.G. Soares , Tatiana S. Porto, Romero M.P.B. Costa, Carolina de A. Lima, Jose L. de Lima Filho, Luana C.B.B. Coelho, Maria T. dos Santos Correia, Maria das G. Carneiro da Cunha, Ana L.F. Porto (2013), “Aqueous two-phase systems: new strategies for separation and purification of lectin from crude extract of
Cratylia mollis seeds”, Separation and Purification Technology, 116, pp.
154–161.
21.David C. Kilpatrick, M.M. Yeoman (1978), “A lectin from seed extracts of
Datura stramonium “, Plant Science Letters, 13(1), pp. 35–40.
22.David C. Kilpatrick (1980), ”Purification and Some Properties of a Lectin
from the Fruit Juice of the Tomato (Lycopersicon esculentum)”, Biochem. J,
185 (1), pp. 269-272.
23.Dorant E, Brandt PA van den, Goldbohm RA, Hermus RJJ and Sturm F (1993), “Garlic and its significance for the prevention of cancer in humans: a
critical view”, British Journal of Cancer, 67, pp. 424– 429.
24.Fatima Clement, Yeldur P. Venkatesh (2010), “Dietary garlic (Allium sativum) lectins, ASA I and ASA II, are highly stable and immunogenic”,
International Immunopharmacology, 10, pp. 1161–1169.
25.Francois J. Joubert, Nathan Sharon and E. H. Merrifield (1986), “Purification and properties of a lectin from lonchocarpus Capassa (apple-leaf) seed”,
26.Gillian I. Franklin, Frank S. Walsh, Edward J. Thompson (1980),
“Endogenous lectins of human muscle”, FEBS Letters, 118 (2), pp. 200–204.
27.Goldstein I. J., Hughes R. C., Monsigny M., Osawa T. and Sharon N. (1980),
“What should be call a lectin?”, Nature (London), 285, pp. 66.
28.Hirst, G. K. (1941), “The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick
embryos infected with influenza virus”, Science, 94(2427), pp. 22-23.
29.Hori K., Keisuke M. & Keiji I. (1990), “Some common properties of lectins
from marine algae”, Hydrobiologia, 204/205, pp. 561- 566.
30.Hung L.D., Trang V.T.D., Ngoc N.T.D. (2011), “High-manose type N- glycan specific lectins from red marine algae, carragenophytes”,
Bootechnology, 9(1), pp. 87- 98.
31.Hung L.D., Ly B. M., Trang V.T.D., Ngoc N.T.D., Hoa L.T.H., Trinh P.T.H. (2012), “A new screening for hemagglutinins from vietnamese marine
macroalgae”, J. Appl. Phycol., 24, pp. 227- 235.
32.Indrajit Dutta, Pralay Majumder, Prasenjit Saha, Krishna Ray, Sampa Das
(2005), “Constitutive and phloem specific expression of Allium sativum leaf agglutinin (ASAL) to engineer aphid (Lipaphis erysimi) resistance in transgenic Indian mustard (Brassica juncea)”, Plant Science, 169(6), pp.
996- 1007.
33.Indrajit Dutta, Prasenjit Saha, Pralay Majumder, Anindya Sarkar, Dipankar Chakraborti, Santanu Banerjee and Sampa Das (2005), “The efficacy of a novel insecticidal protein, Allium sativum leaf lectin (ASAL), against
homopteran insects monitored in transgenic tobacco”, Plant Biotechnology
Journal, 3, pp. 601–611.
34.Irvin Liener (1986), The Lectins: Properties, Functions, and Applications in
Biology and Medicine, Elsevier, pp. 1- 33.
35.Judd, W.J. (1980), “The role of lectin in blood group serology”, CRC Crit.
36.Koen Smeets, Els J.M. Van Damme , Iris Engelborghs , Helen Aelbers , Jan Balzarini , Arpad Pusztai , Fred van Leuven , Irwin J. Goldstein and Willy J. Peumans (1993), “Cloning and characterization of the lectin cDNA
clones from onion, shallot and leek”, Plant Molecular Biology, 23, pp.
365-376.
37.Koen Smeets, Els J.M. Van Damme, Peter Verhaert, Annick Barre, Pierre Rougé, Fred Van Leuven, Willy J. Peumans (1997), “Isolation, characterization and molecular cloning of the mannose-binding lectins from
leaves and roots of garlic (Allium sativum L.)”, Plant Molecular Biology,
32(2), pp. 223-234.
38.Koen Smeets, E.J.M. Van Damme, and W. J. Peumans (1997), “Developmental Regulation of Lectin and Alliinase Synthesis in Garlic
Bulbs and Leaves”, Plant Physiol. Mar, 113(3), pp. 765–771.
39.Lis H., Sharon N. (1986), “Lectin as molecules and as tools”, Annu Rev
Bochem, 55, pp. 35- 67.
40.Lucas D.O. , Klimpel G. (1976), “Differential effects of a mushroom lectin
(abl) on parameters of lymphocyte activation”, Leukocyte Membrane
Determinants Regulating Immune Reactivity, pp. 133.
41.Marta Corzo-Martínez, Nieves Corzo, Mar Villamiel (2007), “Biological
properties of onions and garlic”, Trends in Food Science & Technology, 18
(12), pp. 609–625.
42.Ofek I., Beachey E.H. (1987), “Mannose binding and epithelial cell ad
herence of escherichia coli”, Infect Immun, 22(1), pp. 247- 54.
43.Opender Koul, Suresh Walia and G. S. Dhaliwal (2008), “Essential Oils as
Green Pesticides: Potential and Constraints”, Biopestic. Int., 4(1), pp. 63–84.
44.Peumans, W. J. and Van Damme, E. J. (1995), “The role of lectins in plant
defence”, Histochem J., 27, pp. 253- 271.
45.Renato A. Moreira, Carlos C. Castelo-Branco, Ana C.O. Monteiro, Ricardo O. Tavares, Leila M. Beltramini (1998), “Isolation and partial
characterization of a lectin from Artocarpus incisa L. Seeds”,
Phytochemistry, 47 (7), pp. 1183–1188.
46.Rogers D. J. and Fish (1991), “Marine algal lectins”, Lectin Reviews, 1, pp.
123- 42.
47.Ron J. D. and Slifkin (1997), “Marine algal lectins”, Lectin Reviews, 1, pp.
129- 42.
48.Ryan K. J., Ray C.G. (2004), Sherris Medical Microbiology: An Introduction
to Infectious Diseases, New York.
49.Santanu Bandyopadhyay, Anita Roy, Sampa Das (2001), “Binding of garlic
(Allium sativum) leaf lectin to the gut receptors of homopteran pests is correlated to its insecticidal activity”, Plant Science, 161 (5), pp. 1025–1033.
50.Sharon N., Lis H. (2003), “Lectins”, Kluwer. Academic Pulishers:
Dordrecht, The Netherlands, pp. 63–104.
51.Singh V.K., Singh D.K. (2008), “Pharmacological Effects of Garlic
(Allium sativum L.)”, Annual Review of Biomedical Sciences, 10, pp. 6-26.
52.Sudhir Kumar, Urmila Barros (2012), “Isolation of human erythrocyte
agglutinins from marine algee”, Journal of Natural Pharmaceuticals, 1(1),
pp. 51- 54.
53.Tattelman Ellen (2005), “Health Effects of Garlic”, American Family
Physician, 72(1), pp. 103-106.
54.United States Department of Agriculture (2006), Vegetables and Melons
Outlook, pp. 25- 29.
55.William C. Boyd (1954), “Chapter 22 – The proteins of immune reactions”,
Chemistry, Biological Activity, and Methods, 2 (B), pp. 755–844.
56. https://sites.goom/site/raurungvietnam/rau-than-thao-dhung/cay-toi 57.http://ndb.nal.usda.gov/
PHỤ LỤC Phụ lục 1. Xây dựng đường chuẩn
Bảng PL.1: Kết quả đo OD tương ứng với nồng độ BSA (µg/ml) Nồng độ BSA (µg/ml) STT C- 10 20 40 60 80 100 120 1 0.109 0.121 0.126 0.153 0.183 0.193 0.240 0.249 2 0.107 0.122 0.128 0.144 0.176 0.199 0.252 0.246 3 0.108 0.114 0.129 0.167 0.156 0.186 0.231 0.244 4 0.108 0.114 0.12 0.141 0.174 0.187 0.214 0.223 5 0.111 0.111 0.149 0.146 0.172 0.179 0.193 0.222 6 0.106 0.113 0.12 0.149 0.17 0.171 0.195 0.245
Bảng PL.2: Anova_ Kết quả đo OD tương ứng với nồng độ BSA (µg/ml)
Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups 0.0969 7 0.0138 97.1686 4.52E-23 2.2490 Within Groups 0.0057 40 0.0001 Total 0.1026 47 Kết luận: Vì: F = 97.169 > F 0,05 = 2.249
Bảng PL.3: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA (µg/ml) OD750 Nồng độ BSA (µg/ml) ODTB OD C- 0.108 0 10 0.116 0.008 20 0.129 0.021 40 0.15 0.042 60 0.172 0.064 80 0.179 0.078 100 0.201 0.113 120 0.23 0.13
