Để tìm ra khoảng pH tối ưu của lectin từ lá tỏi, tiến hành thẩm tích lectin qua đêm ở nhiệt độ phòng với các loại đệm có pH khác nhau từ 3 đến 10. Sau đó, tiến hành thẩm tích một lần nữa với NaCl 0,85% để loại bỏ sự ảnh hưởng của pH với hồng cầu thỏ đã được xử lý trypsin .
Kết quả xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi được trình bày trong hình 3.7.
0 10 20 30 40 50 60 70 3 4 5 6 7 8 9 10 pH H o ạ t đ ộ N K H C ( H .U /m l) Hoạt độ NKHC (H.U/ml)
Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi bị ảnh hưởng bởi sư thay đổi của pH, ở 2 môi trường axit và kiềm.
Ở môi trường trung tính, hoạt tính NKHC của lectin từ lá tỏi ta rất ổn định (64 HU/ml) nhưng tại môi trường axit (pH 3-5) và kiềm (pH 9- 10), hoạt độ giảm một nửa (32 HU/ml). Điều này có thể giải thích là vì ở những pH này, lực đẩy tĩnh điện sẽ dễ dàng làm giãn mạch các cấu trúc protein lectin bậc 2 và 3, gây biến tính các protein lectin này, từ đó làm giảm hoạt tính sinh học. Kết quả này tương tự với
(2010), hoạt tính NKHC của ASAI cũng ảnh hưởng bởi môi trường axit và kiềm, trong đó pH 2- 4 gây giảm hoạt tính mạnh hơn pH 8-10 [24].
Theo nghiên cứu của TS. Trương Văn Châu, hoạt độ NKHC của lectin từ mít
na Artocarpus melinoxylus đạt tối ưu trong khoảng pH từ 6,5 đến 8, trong khoảng
pH từ 4 đến 6 hay từ 8 đến 10 khả năng NKHC của lectin giảm mạnh hoặc mất
hoàn toàn [1]. Lectin từ hạt đậu đỏ tây (Phaseolus Vulgais) cho hoạt độ cao trong vùng pH = 7: 8 [3]. Lectin từ hạt chay (A. tonkinensis) hoạt động mạnh nhất ở vùng
pH 8,6 và mất hẳn hoạt độ ở pH 9,5 [5].
So sánh với lectin từ rong biển, hầu hết hoạt độ NKHC của lectin này đều
không bị ảnh hưởng bởi pH, tiêu biểu như rong Ulva pertusa hoạt tính ổn định trong khoảng pH 3- 10 và rong Enteromorpha linza không thay đổi hoạt độ trong
khoảng ph 4-10 [46]. Ngoài ra, khi nghiên cứu tinh sạch và đặc tính của một lectin
ngoại bào (lectin I) từ vi khuẩn Agrobacterium radiobacter NCIM 2443,
Bhagyashree và cộng sự (1997) cho thấy lectin I ổn định ở pH 5 [17].
Như vậy, đối với letin từ thực vật bật cao, khoảng tối ưu của cho hoạt độ NKHC là ở môi trường trung tính, axit yếu và kiềm yếu. Xét về khoảng tối ưu, lectin từ lá tỏi ta cũng nằm trong phạm vi này nhưng, nó có một đặc điểm khác biệt là ở pH 3-5 và pH 9-10 hoạt độ NKHC chỉ giảm một nửa mà không mất hoàn toàn. 3.2.3 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi
Để đánh giá ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính NKHC của lectin từ lá tỏi, tiến hành thẩm tích ở nhiệt độ phòng qua đêm với 400 ml dung dịch EDTA 50 mM. Phần không thẩm tách được thu lại, thử hoạt tính NKHC và so sánh với mẫu đối chứng (không tương tác với EDTA) để xác định sự ảnh hưởng của ion kim loại đến lectin từ lá tỏi. Kết quả được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi Hoạt độ NKHC
Mẫu
HU/ml %
Đối chứng 64 100
Từ kết quả bảng 3.5, mặc dù ngiên cứu chỉ khảo sát sự sảnh hưởng của EDTA đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi ta nhưng đã cho thấy: sự có mặt của ion kim loại không làm thay đổi khả năng NKHC. EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) là một axít hữu cơ mạnh và có khả năng tạo phức với kim loại, cụ thể là lấy ion kim loại ra khỏi cấu trúc lectin. Mẫu lectin sau khi thẩm tích với EDTA được kiểm tra hoạt tính cho kết quả không đổi so với mẫu đối chứng (64 HU/ml).
Kết quả nghiên cứu của David , M.M. Yeoman (1978) đã công bố: letin chiết từ hạt cây cà độc dược Datura không bị ảnh hưởng bởi ion kim loại đến hoạt độ NKHC [21]. Vào năm 1979, David tiếp tục chỉ ra rằng lectin từ nước cà chua không bị ảnh hưởng bởi EDTA [22]. Trong khi đó, nghiên cứu tách một lectin mới (cMoL) từ hạt giống cây đậu dại (chùm ngây), Andre và cộng sự (2009) nhận thấy sự tồn tại của các ion Mg2+ ,Ca2+ và K+ làm tăng tăng hoạt độ NKHC của cMoL [11]. Lectin từ hạt đậu đỏ tây cũng bị ảnh hưởng các cation Ba2+ , Cu2+ , Mg2+ ,Ca2+ và cation Cu2+ là ảnh hưởng mạnh nhất vì ở nồng độ thấp nhất (0,0625 M) đã có tác dụng làm tăng hoạt độ của lectin [3].
Vậy, lectin từ lá tỏi không bị ảnh hưởng bởi ion kim loại sẽ là một tính chất đem lại thuận lợi cho việc nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
3.2.4 Khả năng liên kết cacbohydrate của lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.)
Khảo sát khả năng liên kết cacbohydrate của lectin từ lá tỏi với một số loại đường và glycoprotein bằng cách: cho lectin tương tác với đường hoặc glycoprotein với các nồng độ khác nhau trong vòng 60 phút. Sau đó, tiến hành bổ sung hồng cầu thỏ đã xử lý trypsin vào hỗn hợp trên để đánh giá khả năng gây ức chế hoạt độ NKHC của lectin. Từ đó, tìm ra được giá trị nồng độ nhỏ nhất của đường hoặc glycoprotein mà lectin có thể liên kết được. Giá trị này được tính theo công thức đã được đề cập tới ở mục 2.3.3.3. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6 và hình 3.9.
Bảng 3.6: Nồng độ đường và glycoprotein nhỏ nhất có khả năng ức chế hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi.
Mẫu HI Cmin (mM, µg/ml) D- Mannose - - Đường (100mM) D- Glucose - - Transferrin - - Fetuin - - Yeast mannan 24 6.25 Bovine thyroglobulin 23 25 Glycoprotein (2000µg/ml)
Porcine stomach mucin - -
Chú thích: “-“: Đường 100 mM và glycoprotein 2000 µg/ml không có khả năng gây ức chế hoạt độ NKHC của lectin.
(a1)
Porcine stomach mucin
Yeast mannan
Fetuin
Transferrin HI =
(a2)
(b)
Hình 3.9: Khả năng liên kết cacbohydrate của lectin từ lá tỏi
(a1, a2) Kết quả khả năng liên kết cacbohydrate của lectin từ lá tỏi (b) Hình ảnh minh họa sự tương tác giữa lectin với cacbohydrate
HI = 23 Bovine thyroglobulin
D- Mannose
Theo kết quả từ bảng 3.6, hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi không bị ức chế bởi hai loại đường được kháo sát. Nghĩa là lectin không có khả năng liên kết với D-
Mannose và D-Glucose. Kết quả này khác với lectin chiết từ hạt Lonchocarpus
Capassa (apple-leaf), Francois và cộng sự (1986) đã cho thấy lectin này liên kết D-
Mannose và D-Glucose với Cmin là 4 mM [25]. Nhưng lại tương đồng với với kết quả của Phan Thị Việt Hà (2011) về lectin từ hạt đậu đỏ [3], hay nghiên cứu của
Trần Thị Long, Nguyễn Quốc Khang (1996) về lectin từ hạt chay (A. tonkinensis)
đối với hai loại đường này [5].
Trong khi đó, khảo sát khả khả năng liên kết glycoprotein của lectin cho kết quả 3/5 glycoprotein mà lectin không liên kết, cụ thể là Transferrin, Fetuin và Porcine stomach mucin. Hai glycoprotein còn lại liên kết với lectin với nồng độ khác nhau. Bovine thyroglobulin (25 µg/ml) có khả năng làm ức chế hoạt độ NKHC của lectin vơí nồng độ cao hơn Yeast mannan (6,25 µg/ml ).
Theo Andréa và cộng sự (2009), khác với lectin từ lá tỏi, lectin chiết từ mô lá cây đậu dại có khả năng liên kết với Fetuin [11]. Tuy nhiên, kết quả này có có điểm
tương đồng với lectin chiết từ rong đỏ K. striatum về khả năng liên kết với Yeast
mannan và Bovine thyroglobulin nhưng với nồng độ gây ức chế nhỏ hơn lectin từ lá
tỏi (Allium sativum L.) [9].
Ngược lại với lectin từ rong biển, hầu hết tương tác với glycoprotein. Các lectin thu nhận từ thực vật bậc cao lại có khả năng tương tác mạnh với các loại đường đơn [30], nên cần mở rộng phạm vi thử nghiệm liên kết các loại đường đơn cho lectin từ lá tỏi để có kết quả bao quát hơn, kể cả với glycoprotein.
Tìm hiểu cấu trúc của glycoprotein tương tác mạnh với lectin trong thí nghiệm trên cho thấy, Yeast mannan có cấu trúc lõi là oligo- saccharide N-glycan dạng high-mannose. Từ đó có thể thấy rằng, lectin từ lá tỏi có tính đặc hiệu tương đôí cao với glycoprotein N-glycan dạng high-mannose. Đây là dạng glycoprotein xuất hiện xuất hiện nhiều trên lớp vỏ của hầu hết các virus gây bệnh, đặc biệt là HIV và HBV [30]. Theo nghiên cứu của Koen Smeet và cộng sự (1993) về nhân bản và đặc tính của các dòng vô tính lectin cDNA từ hành tây, hẹ và tỏi tây cho thấy
các lectin từ hẹ (A. ascalonicum) và tỏi tây (A. porrum) có hoạt tính kháng virus đáng kể khi thử nghiệm chống lại HIV-1 và HIV-2, trong khi tỏi thuộc loài A.
sativum và A. ursinum chứa lectin gắn kết mannose rất phong phú nhưng không có
hoạt tính kháng virus [36]. Tuy nhiên, theo kết quả của nghiên cứu này, có thể dự
đoán có sự khác biệt giữa lá tỏi (Allium sativum L.) trồng ở Việt Nam so với ở nước
ngoài (Ấn Độ) thể hiện qua khả năng tương tác với Yeast mannan của lectin từ lá tỏi. Vì vậy cần nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc của lectin từ lá tỏi Việt Nam để làm rõ vấn đề và có thể sẽ mang lại kết quả khả quan hơn trong việc phòng chống và ngăn chặn các bệnh nan y hiện nay.
3.3.5 Khả năng kháng khuẩn của lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.)
Đĩa thạch sau khi được trải vi khuẩn và bổ sung 20 µl dịch lectin nồng độ 10,82 mg/ml vào giấy, sẽ được ủ ở 370C trong 24 giờ. Hoạt độ kháng khuẩn của lectin từ lá tỏi được tính bằng mm đường kính vòng vô khuẩn trên đĩa thạch.
Kết quả được trình bày trong bảng 3.7 và hình 3.10.
Bảng 3.7: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng một số vi khuẩn của lectin từ lá tỏi Kí
hiệu
Vi khuẩn Đặc điểm vi khuẩn Đường kính vòng
vô khuẩn (mm)
EC Escherichia Coli
Gam (-), hình que.
Gây bệnh viêm nhiễm đường ruột ở người
-
T12 Vibrio harveye
Gam (-), hình que.
Gây bệnh cho động vật biển sò, cá đặc biệt là tôm .
-
SA Staphylococcus aureus
Gam (+)
Gây bệnh viêm nhiễm da ở người -
BC Bacillus cereus Gam (+), hình que.
Gây ngộ độc thực phẩm [48]. -
SF Streptococcus faecalis
Gam (+)
PA Pseudomonas aeruginosa
Gam (-), hình que.
Gây viêm nhiễm ở người và độc vật, kháng kháng sinh .
-
T5 Enterobacter cloace
Gam (-).
Gây viêm đường tiết niệu, nhiễm trùng đường hô hấp [15].
12
Chú thích: “-“: Đường kính vòng kháng khuẩn bằng 0
(a) Enterobacter cloace (T5)
(b) Streptococcus faecalis (SF)
Hình 3.10: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng một số vi khuẩn của lectin từ lá tỏi. 12
Kết quả từ bảng 3.7 cho thấy, lectin từ lá tỏi có khả năng kháng lại 1/7 loài vi khuẩn gây bệnh đường kính vòng vô khuẩn là 12 mm. Từ hình 3.9 nhận thấy rõ sự khác biệt của việc kháng hay không kháng vi khuẩn: mẫu đối chứng bằng dung dịch
đệm PBS cho kết quả âm tính với cả hai mẫu vi khuẩn Enterobacter cloace (T5) và
Streptococcus faecalis (SF), có nghĩa khả năng kháng khuẩn là do chính lectin từ lá
tỏi gây nên (nếu có); mẫu đối chứng bằng ampicillin cũng là một minh họa cụ thể,
tại thử nghiệm kháng vi khuẩn T5, lectin từ lá tỏi và ampicillin đều cho kết quả dương tính với đường kính vòng vô khuẩn là 12 mm, tức là khả năng kháng T5 của
chúng là như nhau.
Ngoài ra, dựa vào kết quả từ bảng 3.7 vẫn chưa thể kết luận: lectin từ lá tỏi không có khả năng kháng với 6/7 loài vi khuẩn. Vì, mẫu lectin từ lá tỏi dùng trong nghiên cứu này có nồng độ % lectin thấp do bị pha loãng sau quá trình thẩm tách. Nên, để đảm bảo đưa ra kết luận chính xác thì cần nghiên cứu tăng nồng độ % lectin bằng phương pháp ultraftli trước khi tiến hành thử nghiệm kháng khuẩn.
Các loại vi khuẩn trên được biết đến như là những tác nhân gây ra những căn bệnh nguy hiểm cho người và động vật như: gây viêm nhiễm, gây ngộ độc …Mặt khác, có mầm bệnh đã kháng rất nhiều kháng sinh thông dụng, vì vậy việc chữa trị và loại bỏ chúng ngày càng gặp nhiều khó khăn và tốn kém [13], [48]. Do đó, khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh của lectin từ lá tỏi sẽ là một trong những phát triển quan trọng nhằm định hướng sử dụng lectin như là một công cụ hữu hiệu trong tương lai. Và để có thể phát triển rộng hơn về định hướng này, cần thử nghiệm thêm khả năng kháng khuẩn với nhiều chủng loại vi khuẩn hơn.
Tóm lại, qua kết quả nghiên cứu của đồ án cho thấy tính chất hóa lý và sinh học của lectin sẽ là những tiền đề quan trọng và thuận lợi bước đầu để tiếp tục nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, chẳng hạn lĩnh vực y sinh, nông nghiệp.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu được qua quá trình nghiên cứu đã rút ra kết luận cho quy trình thu nhận và khảo sát tính chất hóa lý và đặc tính sinh học của lectin chiết
từ lá tỏi (Allium sativum L.) như sau:
Đã tìm được các điều kiện thích hợp để chiết lectin từ lá tỏi:
+ Dung môi chiết: dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85% NaCl) pH= 7,4.
+ Nhiệt độ chiết: nhiệt độ phòng.
+ Tỷ lệ nguyên liệu : dung môi chiết (w/v): 1: 6. + Thời gian chiết : 8 giờ.
Bằng phương pháp kết tủa protein lectin bằng muối amoni sunfate nồng độ 50% để sau 6 giờ ở nhiệt độ 150C, thu được chế phẩm lectin kỹ thuật có hoạt độ NKHC là 29, hoạt độ riêng là 47,32 HU/mg và hoạt độ tổng số là 3584 HU, nồng độ protein nhỏ nhất gây NKHC là 21,13 µg.ml-1.
Đã xác định được một số tính chất hóa lý của lectin từ lá tỏi (Allium
sativum L.):
+ Lectin có khả năng bền nhiệt, khoảng nhiệt độ hoạt động từ 20- 600C và ổn định ở vùng nhiệt độ từ 20- 500C (duy trì 100% hoạt tính sau 30 phút phản ứng).
+ Hoạt tính NKHC không thay đổi ở vùng pH 6- 8, giảm 50% ở pH 3- 5 và pH 9- 10.
+ Không bị mất hoạt tính khi có mặt của EDTA với nồng độ 50 mM.
Bước đầu xác định đặc tính sinh học của lectin từ lá tỏi (Allium
sativum L.)
+ Lectin không có khả năng liên kết với tất cả cá loại đường trong thí nghiệm, chỉ liên kết với 2/5 loại glycoprotein ở nồng độ khac nhau là: Yeast mannan, Bovine thryroglobulin.
2. KIẾN NGHỊ
Để hoàn thiện hơn quá trình tinh sạch và đảm bảo tính thuyết phục của kết quả thu được, chúng tôi có những kiến nghị sau đây:
1. Tiến hành xác định khối lượng phân tử lectin từ lá tỏi ta bằng phương pháp sắc ký lọc gel.
2. Tiến hành cô đặc dịch sau thẩm tích bằng phương pháp ultraftli.
3. Tiến hành mở rộng xác định khả năng liên kết với nhiều loại đường và glycoprotein khác nhau.
4. Tiến hành mở rộng xác định khả năng kháng khuẩn với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh khác nhau
5. Hoàn thiện quy trình thu chế phẩm lectin từ lá tỏi ta ở quy mô phòng thí nghiệm và pilot.
6. Nguyên cứu điều kiện bảo quản chế phẩm.
7. Ứng dụng chế phẩm lectin trong một số lĩnh vực như y dược hoặc nông nghiệp
Ngoài ra, có thể tiến hành thử nghiệm nghiên cứu tách chiết và xác định đặc tính hóa lý và sinh học của lectin từ các loại thực vật một lá mầm khác để có thể ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Trương Văn Châu (2004), “Một số tính chất háo sinh của Lectin mít na”, tạp
chí khoa học ĐHSP Hà Nội, 4, pp. 83-87.
2. Võ Văn Chi (2003), Tự điển thực vật thông dụng- Tập I, Nhà xuất bản khoa
học kỹ thuật.
3. Phan Thị Việt Hà (2011), Nghiên cứu chiết tách, khảo sát tính chất của
lectin từ hạt đậu đỏ tây (phaseolus vulgaris), Luận Văn Thạc sĩ kỹ thuật, Đại
Học Đà Nẵng, Đà Nẵng.
4. Đỗ Ngọc Liên, Trần Tuấn Quỳnh (1991), “Tách tinh chế và một số tính chất
của lectin từ hạt chay A. tonkinensis”, Tạp chí khoa học, 13(2), pp. 20- 27.
5. Trần Thị Long, Nguyễn Quốc Khang (1996), “Tinh sạch và một vài đặc