Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp của Lowry và cộng sự năm 1951 [6], dùng Albumin huyết thanh bò (BSA- Bovine serum albumin) làm chất chuẩn.
Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở phức chất đồng - protein khử hỗn hợp photphomolipden photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong phạm vi nhất định. Đo cường độ màu bằng thiết bị đo màu quang điện ở bước sóng 750 nm. Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được hàm lượng protein cần phân tích.
Hóa chất
Thuốc thử A: 20 g Na2CO3 và 4 g NaOH 0,1 M pha trong 1000 ml nước cất. Thuốc thử B: Sodium citrate 1% (1,14 g pha trong 100 ml nước cất).
Thuốc thử C: CuSO4 .5H2O 0,5% (0,5 g pha trong 100 ml nước cất).
Dung dịch hỗn hợp thuốc thử: hỗn hợp của 3 dung dịch A: B: C theo tỉ lệ 50: 1: 1 (yêu cầu pha trước khi sử dụng).
Thuốc thử Folin: pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng. Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bò (BSA) 1 mg/ml.
Xây dựng đường chuẩn
Cân 10 mg BSA hòa tan trong 10ml nước cất, ta được dung dịch gốc có nồng độ 1 mg/ml. Sau đó, pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất thành các nồng độ 10, 20, 40, 60, 80, 100 và 120 µl/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn.
Lấy chính xác 0,5 ml dịch chứa BSA với các nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 ml dung dịch hỗn hợp thuốc, lắc đều để yên trong 20 phút. Sau đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 60 phút. Đem so màu của hỗn hợp ở bước sóng 750 nm. Mẫu trắng (C): thay dịch chứa BSA bằng nước cất, các bước còn lại tiến hành tương tự.
Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi quy.
Mẫu thí nghiệm
Lấy 0,5 ml dịch protein cần kiểm tra cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 ml dung dịch hỗn hợp thuốc, lắc đều để yên trong 20 phút. Sau đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 60 phút. Đem so màu của hỗn hợp ở bước sóng 750 nm.. Mẫu trắng: thay dịch protein bằng nước cất, các bước còn lại tiến hành tương tự. Sau đó, đem so màu ở bước sóng 750 nm. Kết quả được tính dựa vào đường chuẩn protein. Làm thí nghiệm với mẫu kép và lấy giá trị trung bình.