Đối tượng nghiên cứu: Tỏi (Allium sativum L.) thu ở xã Vạn Hưng, huyện Vạn Ninh, tỉnh Khánh Hòa vào ngày 24/02/2014.
Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang- Tp Nha Trang- tỉnh Khánh Hòa; Trung tâm thực hành thí nghiệm trường ĐH Nha Trang.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1/3/2014 đến tháng 6/6/2014. 2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
2.2.1 Vật liệu
Trong nghiên cứu này, vật liệu dùng để tiến hành thí nghiệm là lá cây tỏi
(Allium sativum L.). Tỏi được thu mua nguyên cây, tại phòng thí nghiệm được cắt riêng từng bộ phận củ, lá, rễ. Lá cây tỏi ta được cho vào các túi nilong (kích thước 25 x 35 cm), cho vào tủ đông -200C để bảo quản.
Hồng cầu của máu thỏ lấy từ Viện Vaccine – Nha Trang, được cung cấp hàng tuần.
Chủng vi sinh vật được cung cấp từ bộ sưu tập của phòng Công nghệ sinh học biển -Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang.
2.2.2 Hóa chất
- Các loại đường chuẩn và glycoprptein: D- glucose, D- mannose, Transferrin, fetuin, Yeast mannan, Bovine thyroglobulin, Porcine stomach mucin: mua từ Merck- Đức.
- Na2HPO4.12H2O, NAH2PO4.2H2O, NaCl, Na2CO3, NaOH, sodium citrat, CUSO4.5H2O, (NH4)2SO4, acitic acid, acetat natri, HCl, NaHCO3, EDTA: mua của Trung Quốc.
- BSA, Enzym trypsin: Signa – Aldrich, Mỹ.
- Yeast Extract Powder (dịch chiết nấm men), Peptone: mua của Himedia, Ấn Độ; K2HPO4, MgSO4: mua của Merck- Đức; Agar mua từ Việt Nam.
2.2.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu
Bảng 2.1: Các thiết bị, dụng cụ chính được sử dụng trong thí nghiệm
STT Thiết bị, dụng cụ Model máy, vật
liệu, dung tích Xuất sứ
1
Máy đo quang Microplate
- Khay Elisa 96 giếng mã số G655061 (40 chiếc/ thùng) - 1 bộ máy vi tính và máy in, Gen 5 ELISA.
Elx 808 Bio Tek– USA
2 Máy ly tâm Z36HK Hermel- Đức
3 Máy ly tâm tốc độ cao 5417R Eppendorf- Đức
4 Máy đo pH 827pH Lab Metrohm- Thụy Sỹ
5 Máy khuấy hình đĩa siêu phẳng
(x4) CB 162 Stuart- UK
6 Máy lắc (lắc kiểu tròn) 3017 GFL- Đức
7 Tủ ấm ON- 11E Gallenkamp
8 Tủ cấy vi sinh AV – 100 Telstar-Tây Ban
Nha
9 Tủ sấy chân không XF020 Etuves- Pháp
10 Tủ sấy Model ON - 11E Gallenkamp
11 Nồi hấp khử trùng ES- 315 TOMY- Nhật
12 Khay 96 giếng đáy chữ V Polystyrene Greiner- Đức
13 Micropipet 8 lỗ 5-50 µl Titertek
14 Micropipet 2-20 µl Nichiryo- Nhật
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Bố trí thí nghiệm thu nhận lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.)
2.3.1.1 Quy trình dự kiến thu nhận lectin từ lá tỏi a. Sơ đồ quy trình dự kiến a. Sơ đồ quy trình dự kiến
Hình 2.1: Sơ đồ quy trình dự kiến thu nhận lectin từ lá tỏi b. Giải thích quy trình
Cân m (g) lá tỏi đã cắt nhỏ, xay nhuyễn. Tiến hành ngâm chiết theo các thông số thích hợp, rồi lọc loại bã. Tiếp theo, quá trình tủa lectin được tiến hành bằng amonium sunfate, sau đó ly tâm thu tủa. Phần tủa được hòa tan đến một thể
Chế phẩm lectin kỹ thuật
Loại tủa Hòa tan kết tủa
Thông số chiết thích hợp Loại bã Lá tỏi Cắt nhỏ, xay nhuyễn Cân mẫu Ngâm chiết Kết tủa lectin Lọc Ly tâm Thẩm tích Ly tâm
tích nhất định trước khi thẩm tích bằng dung dịch đệm phoshate (PBS 0,02M; 0,85% NaCl), để loại bỏ amonium sunfate còn dư. Cuối cùng dịch tủa sau thẩm tích được ly tâm để thu phần dịch trong, đây chính là chế phẩm lectin kỹ thuật.
c. Xác định các điều kiện tối ưu để chiết lectin từ lá tỏi
Phương pháp khảo sát: khi khảo sát một yếu tố nào đó trong quá trình tách chiết như nồng độ dung môi, tỷ lệ chiết, thời gian chiết,… thì các yếu tố còn lại được cố định. Yếu tố nào đã khảo sát thì sẽ được cố định ở giá trị tối ưu để tiếp tục khảo sát đến các yếu tố khác.
Các điều kiện được khảo sát trong thí nghiệm này là tỷ lệ chiết và thời gian chiết, không tiến hành khảo sát 2 yếu tố: dung môi chiết và nhiệt độ chiết.
Từ nghiên cứu trước đây [10], khi khảo sát dung môi chiết thường tiến hành trên 3 hệ dung môi: nước cất, dung dịch đệm phosphat (PBS 0,02 M; NaCl 0,85%) và ethanol n%. Kết quả hầu hết cho thấy ethanol n% có HĐTS và HĐR của lectin cao nhưng không chênh lệch nhiều so với dung dịch đệm phosphat. Điều này có thể là do tính tan của lectin, chúng dễ hòa tan trong dung dịch muối, mặt khác sự có mặt của PBS giúp ổn định pH của môi trường, phù hợp với khả năng khuếch tán của lectin. Xét về tính kinh tế, việc ngâm chiết bằng dung môi ethanol sẽ tạo chế phẩm có giá thành cao hơn nhiều so với dung dịch đệm phosphate (bao gồm giai đoạn chiết và thu chế phẩm lectin kỹ thuật bằng tác nhân tủa). Vì mục tiêu sau cùng của nghiên cứu này là đưa chế phẩm lectin ra thị trường tiêu thụ, được sự chấp nhận của người dân, giá thành sản phẩm phải phù hợp và có sức cạnh tranh cao nên việc sử dụng dung dịch đệm phosphat (PBS 0,02 M; NaCl 0,85%) làm dung môi chiết là rất phù hợp.
Đối với yếu tố nhiệt độ, khi khảo sát chiết ở nhiệt độ phòng và 40C thì với bản chất protein của lectin sẽ cho kết quả chiết ở 40C bằng hoặc tốt hơn ở nhiệt độ phòng. Tuy nhiên, vì cùng một lý do như đã nêu trên, xét về tính thuận tiện và giá thành chế phẩm thì việc chiết ở nhiệt độ phòng lại phù hợp hơn. Do đó, nhiệt độ phòng được chọn làm thông số nhiệt độ chiết trong nghiên cứu này.
d. Xác định nồng độ ammonium sunfate thích hợp để tủa lectin từ DC lá tỏi
Mỗi loại tác nhân tủa thường có khả năng làm kết tủa protein lectin ở những nồng độ khác nhau và có ảnh hưởng khác nhau đến hoạt độ NKHC sau khi kết tủa. Lựa chọn amonium sunfate là tác nhân tủa cho nghiên cứu này vì các lý do sau đây:
+ Không làm hại mà làm bền (ổn định) hầu hết các loại protein + Rẻ tiền và phổ biến
+ Độ hòa tan rất lớn ngay ở nhiệt độ thấp (bão hòa 767 g/l ở 25oC)
+ Tính kết tủa lựa chọn của muối amino sunfate cao hơn các loại muối khác. + Có thể sử dụng aminoum sunfate ở 2 dạng: bột và dung dịch bão hòa. Tiến hành khảo sát khả năng tủa của protein lectin từ DC bằng amonium sunfate ở các nồng độ khác nhau (40- 90%) để cô đặc lectin có trong DC lá tỏi. 2.3.1.2 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) đến hoạt độ NKHC của dịch chiết (DC) từ lá tỏi (TN1)
Hình 2.2: Sơ đồ quy trình xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) đến hoạt độ NKHC của DC từ lá tỏi.
Dịch chiết
- Xác định hàm lượng protein tổng số - Xác định hoạt độ lectin
Ngâm chiết lectin trong dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M; 0,85% NaCl) ở nhiệt độ phòng, thời gian chiết: 6 giờ, tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch đệm phosphate thay đổi:
Lá tỏi
Cắt nhỏ, xay nhuyễn
Cân mẫu
1:5 1:6 1:7 1:8 1:9
b. Giải thích quy trình
Cân m = 10 (g) lá tỏi (bảo quản đông) đã cắt nhỏ, xay nhuyễn. Tiến hành ngâm chiết lectin trên máy lắc với vận tốc 17 vòng/ phút bằng dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85% NaCl) ở nhiệt độ phòng với thời gian chiết là 6 giờ và tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch đệm (w/v) thay đổi lần lượt là 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9. Sau đó, lọc qua lưới lọc rồi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 15 phút để loại bã, thu DC.
Xác định hàm lượng protein tổng số, hoạt độ tổng số (HĐTS) và hoạt độ riêng (HĐR), nồng độ protein nhỏ nhất gây NKHC (MAC) của từng DC. So sánh, chọn ra tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch đệm phosphate (w/v) thích hợp.
2.3.1.3 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hoạt độ NKHC của DC từ lá tỏi (TN2) hoạt độ NKHC của DC từ lá tỏi (TN2)
Hình 2.3: Sơ đồ quy trình xác định ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hoạt độ NKHC của DC từ lá tỏi. Dịch chiết Lọc - Xác định hàm lượng protein tổng số - Xác định hoạt độ lectin Loại bã 2 giờ 4 giờ 6 giờ 8 giờ 12 giờ 18 giờ 24 giờ
Cắt nhỏ, xay nhuyễn
Cân mẫu
Ngâm chiết lectin trong dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M; 0,85% NaCl) ở nhiệt độ phòng, tỷ lệ chiết tối ưu từ TN1, thời gian chiết thay đổi:
b. Giải thích quy trình
Cân m = 10 (g) lá tỏi đã cắt nhỏ, xay nhuyễn. Tiến hành ngâm chiết lectin trên máy lắc với vận tốc 17 vòng/ phút bằng dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85% NaCl) ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch đệm (w/v) tối ưu từ TN1 và thời gian chiết thay đổi lần lượt là 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24 (giờ). Sau đó, lọc qua lưới lọc rồi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 15 phút để loại bã, thu DC. Xác định hàm lượng protein tổng số, hoạt độ tổng số (HĐTS) và hoạt độ riêng (HĐR), nồng độ protein nhỏ nhất gây NKHC (MAC) của từng DC. So sánh, chọn ra thời gian chiết (giờ) thích hợp.
2.3.1.4 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ % (NH4)2SO4 đến hoạt độ NKHC và hiệu suất thu hồi lectin từ DC lá tỏi (TN3) hoạt độ NKHC và hiệu suất thu hồi lectin từ DC lá tỏi (TN3)
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình xác định ảnh hưởng của nồng độ % amonium sunfate (NH4)2SO4 đến hoạt độ NKHC và hiệu suất thu hồi lectin từ DC lá tỏi.
Ly tâm
- Xác định hàm lượng protein tổng số - Xác định hoạt độ lectin
Hòa tan kết tủa
Dịch trong Dịch tủa
Kết tủa lectin
(amonium sunfate có nồng độ thay đổi)
40% 50% 60% 70% 80% 90%
- Dung môi chiết: Dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02M, 0,85% NaCl) - Nhiệt độ chiết: nhiệt độ phòng
- Tỷ lệ chiết tối ưu từ TN1 - Thời gian chiết tối ưu từ TN2 Loại bã Lá tỏi Cắt nhỏ, xay nhuyễn Cân mẫu Ngâm chiết Lọc
b. Giải thích quy trình
Cân m = 25 (g) lá tỏi đã cắt nhỏ, xay nhuyễn. Tiến hành ngâm chiết lectin trên máy lắc với vận tốc 17 vòng/ phút theo các thông số đã xác định ở các thí nghiệm trên: dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85% NaCl) ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch đệm phosphate (w/v) tối ưu từ TN1 và thời gian chiết tối ưu từ TN2. Tiếp theo, lọc qua lưới lọc rồi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 15 phút để loại bã, thu DC. Sau đó, tiến hành kết tủa lectin bằng amonium sunfate với nồng độ thay đổi lần lượt là 40, 50, 60, 70, 80, 90 (%), để qua đêm ở nhiệt độ 180C. Cuối cùng, ly tâm dịch sau tủa ở 180C với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 10 phút để tách riêng tủa và dịch trong.Tủa thu được hòa tan với dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85 % NaCl) và đưa về cùng một thể tích, gọi là dịch tủa.
Xác định hàm lượng protein tổng số, hoạt độ tổng số (HĐTS) và hoạt độ riêng (HĐR), nồng độ protein nhỏ nhất gây NKHC (MAC), hiệu suất thu hồi của từng dịch tủa và dịch trong. So sánh, chọn ra nồng độ % (NH4)2SO4 thích hợp. 2.3.2 Thí nghiệm nghiên cứu tính chất hóa lý (ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, ion kim loại và khả năng liên kết cacbohydrate) và đặc tính sinh học (khả năng
kháng khuẩn) của lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.) (TN4)
Hình 2.5: Sơ đồ quy trình thu nhận lectin từ lá tỏi để xác định tính chất hóa lý và đặc tính sinh học của nó. Loại bã Kết tủa lectin (% (NH4)2SO4 tối ưu từ TN3) Lá tỏi Cắt nhỏ, xay nhuyễn Cân mẫu Ngâm chiết Lọc
- Dung môi: Dung dịch đệm
phosphate (PBS 0,02 M, 0,85% NaCl) - Nhiệt độ chiết: nhiệt độ phòng
- Tỷ lệ chiết tối ưu từ TN1 - Thời gian chiết tối ưu từ TN2
Chế phẩm lectin kỹ thuật
Loại tủa Hòa tan kết tủa
Ly tâm
Thẩm tích
Ly tâm
Xác định: Ảnh hưởng của nhiệt độ Ảnh hưởng của pH
Ảnh hưởng của cation hóa trị
Khả năng liên kết cacbohydrate
Khả năng kháng khuẩn Túi thẩm tích
Rửa Đun sôi
b. Giải thích quy trình
Cân m = 76,69 (g) lá tỏi đã cắt nhỏ, xay nhuyễn. Tiến hành ngâm chiết lectin trên máy lắc với vận tốc 17 vòng/ phút theo các thông số đã xác định ở các thí nghiệm trên: dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85% NaCl) ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch đệm phosphate (w/v) tối ưu từ TN1 và thời gian chiết tối ưu từ TN2. Tiếp theo, lọc qua lưới lọc rồi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 15 phút để loại bã, thu DC. Sau đó, tiến hành kết tủa lectin bằng amonium sunfate với nồng độ 50% được để qua đêm ở nhiệt độ 18 0C. Cuối cùng, ly tâm dịch sau tủa ở 180C với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 10 phút để thu tủa. Tủa thu được hòa với dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85% NaCl), để loại bỏ amonium sunfate còn dư và pha loãng alicin có trong dịch tủa. Cuối cùng, dịch tủa sau thẩm tích được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 10 phút để loại tủa, thu phần dịch trong, đây chính là chế phẩm lectin kỹ thuật.
Chuẩn bị túi thẩm tích: túi thẩm tích cần được đun sôi và rửa bằng nước cất để loại bỏ tạp chất có trong túi.
Dùng sản phẩm này để xác định tính chất hóa lý: ảnh hưởng của các tác nhân (nhiệt độ, pH, ion kim loại), khả năng liên kết cacbohydrate và đặc tính sinh học : khả năng kháng khuẩn.
c. Xác định ảnh hưởng của các tác nhân: nhiệt độ, pH, ion kim loại đến hoạt tính NKHC của lectin
(Yêu cầu: đưa hoạt tính của dịch mẫu về khoảng 26).
Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ
Cho 0,5 -1 ml mẫu dung dịch lectin đun nóng tại những nhiệt độ khác nhau: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 (0C) trong 30 phút, sau đó làm lạnh ngay trong đá và đo lại hoạt tính NKHC để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính NKHC của lectin.
Xác định ảnh hưởng của pH
Cho 0,5 -1 ml mẫu dung dịch lectin thẩm tách với dung dịch đệm ở nhiệt độ phòng, qua đêm với các pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Sau đó, thẩm tích ngược lại với NaCl 0,85%.
Phần sau thẩm tích được thu lại và thử hoạt tính NKHC để xác định sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính NKHC của lectin.
Những dung dịch đệm được sử dụng:
Đệm acetate pH: 3, 4, 5 ( acitic acid/ acetat natri)
Đệm phosphate pH: 6, 7 (Na2HPO4.12H2O/ NAH2PO4.2H2O)
Đệm tris HCl pH: 8 (Tris/ HCl)
Đệm carbonate pH: 9, 10 (Na2CO3/ NaHCO3)
Xác định ảnh hưởng của ion kim loại
Cho 0,2 ml dịch mẫu lectin thẩm tích ở nhiệt độ phòng qua đêm với 400 ml dung dịch EDTA 50 mM.
Phần không thẩm tích được thu lại, thử hoạt tính NKHC và so sánh với mẫu đối chứng (không tương tác với EDTA) để xác định sự ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính NKHC của lectin.
2.3.3 Phương pháp phân tích
2.3.3.1 Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu (NKHC) [48] (NKHC) [48]
Chuẩn bị huyền phù hồng cầu (HC) 2% - Lấy máu từ thỏ.
- Cho 20 ml máu vào 2 ml dung dịch chống đông máu bao gồm: C6H5Na3O7.2H2O, NaH2PO4, acid citric C6H8O7.2H2O và dextrose.
- Mẫu máu được rửa từ 3-5 lần với 50 thể tích dung dịch đệm phosphat (PBS 0,02 M; NaCl 0,85%). Sau khi rửa, huyền phù HC 2% được điều chế trong dung dịch đệm phosphat và được dùng như HC tự nhiên.
- Hồng cầu xử lý trypsin được chuẩn bị như sau: 1/10 thể tích của dung dịch trypsin 0,5% (w/v) được cho vào huyền phù HC tự nhiên 2% (v/v) của HC được xử lý trypsin.
+ Rửa hồng cầu bằng NaCl 0,85%: dung dịch muối sinh lý sẽ không làm ảnh hưởng đến HC, giữ HC lâu hơn, rửa sạch HC bị vỡ và bạch cầu.
+ Xử lý HC 2% bằng enzyme: protein cuộn tròn các nhóm carbohydrate ở bên trong nên lectin không thể liên kết được. Enzyme sẽ cắt ngắn mạch protein để lộ các nhóm cacbohydrate, tương tác với lectin.
+ Rửa lại hồng cầu bằng dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M; NaCl 0,85%): nhằm loại bỏ HC tồn tại trên bề mặt tế bào máu và một phần enzyme còn sót lại.
HC được sử dụng trong các thí nghiệm xác định hoạt độ NKHC của lectin là HC thỏ 2% đã xử lý trypsin.