hoạt độ NKHC và hiệu suất thu hồi lectin từ DC lá tỏi (TN3)
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình xác định ảnh hưởng của nồng độ % amonium sunfate (NH4)2SO4 đến hoạt độ NKHC và hiệu suất thu hồi lectin từ DC lá tỏi.
Ly tâm
- Xác định hàm lượng protein tổng số - Xác định hoạt độ lectin
Hòa tan kết tủa
Dịch trong Dịch tủa
Kết tủa lectin
(amonium sunfate có nồng độ thay đổi)
40% 50% 60% 70% 80% 90%
- Dung môi chiết: Dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02M, 0,85% NaCl) - Nhiệt độ chiết: nhiệt độ phòng
- Tỷ lệ chiết tối ưu từ TN1 - Thời gian chiết tối ưu từ TN2 Loại bã Lá tỏi Cắt nhỏ, xay nhuyễn Cân mẫu Ngâm chiết Lọc
b. Giải thích quy trình
Cân m = 25 (g) lá tỏi đã cắt nhỏ, xay nhuyễn. Tiến hành ngâm chiết lectin trên máy lắc với vận tốc 17 vòng/ phút theo các thông số đã xác định ở các thí nghiệm trên: dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85% NaCl) ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch đệm phosphate (w/v) tối ưu từ TN1 và thời gian chiết tối ưu từ TN2. Tiếp theo, lọc qua lưới lọc rồi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 15 phút để loại bã, thu DC. Sau đó, tiến hành kết tủa lectin bằng amonium sunfate với nồng độ thay đổi lần lượt là 40, 50, 60, 70, 80, 90 (%), để qua đêm ở nhiệt độ 180C. Cuối cùng, ly tâm dịch sau tủa ở 180C với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 10 phút để tách riêng tủa và dịch trong.Tủa thu được hòa tan với dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85 % NaCl) và đưa về cùng một thể tích, gọi là dịch tủa.
Xác định hàm lượng protein tổng số, hoạt độ tổng số (HĐTS) và hoạt độ riêng (HĐR), nồng độ protein nhỏ nhất gây NKHC (MAC), hiệu suất thu hồi của từng dịch tủa và dịch trong. So sánh, chọn ra nồng độ % (NH4)2SO4 thích hợp. 2.3.2 Thí nghiệm nghiên cứu tính chất hóa lý (ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, ion kim loại và khả năng liên kết cacbohydrate) và đặc tính sinh học (khả năng
kháng khuẩn) của lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.) (TN4)
Hình 2.5: Sơ đồ quy trình thu nhận lectin từ lá tỏi để xác định tính chất hóa lý và đặc tính sinh học của nó. Loại bã Kết tủa lectin (% (NH4)2SO4 tối ưu từ TN3) Lá tỏi Cắt nhỏ, xay nhuyễn Cân mẫu Ngâm chiết Lọc
- Dung môi: Dung dịch đệm
phosphate (PBS 0,02 M, 0,85% NaCl) - Nhiệt độ chiết: nhiệt độ phòng
- Tỷ lệ chiết tối ưu từ TN1 - Thời gian chiết tối ưu từ TN2
Chế phẩm lectin kỹ thuật
Loại tủa Hòa tan kết tủa
Ly tâm
Thẩm tích
Ly tâm
Xác định: Ảnh hưởng của nhiệt độ Ảnh hưởng của pH
Ảnh hưởng của cation hóa trị
Khả năng liên kết cacbohydrate
Khả năng kháng khuẩn Túi thẩm tích
Rửa Đun sôi
b. Giải thích quy trình
Cân m = 76,69 (g) lá tỏi đã cắt nhỏ, xay nhuyễn. Tiến hành ngâm chiết lectin trên máy lắc với vận tốc 17 vòng/ phút theo các thông số đã xác định ở các thí nghiệm trên: dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85% NaCl) ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch đệm phosphate (w/v) tối ưu từ TN1 và thời gian chiết tối ưu từ TN2. Tiếp theo, lọc qua lưới lọc rồi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 15 phút để loại bã, thu DC. Sau đó, tiến hành kết tủa lectin bằng amonium sunfate với nồng độ 50% được để qua đêm ở nhiệt độ 18 0C. Cuối cùng, ly tâm dịch sau tủa ở 180C với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 10 phút để thu tủa. Tủa thu được hòa với dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85% NaCl), để loại bỏ amonium sunfate còn dư và pha loãng alicin có trong dịch tủa. Cuối cùng, dịch tủa sau thẩm tích được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 10 phút để loại tủa, thu phần dịch trong, đây chính là chế phẩm lectin kỹ thuật. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chuẩn bị túi thẩm tích: túi thẩm tích cần được đun sôi và rửa bằng nước cất để loại bỏ tạp chất có trong túi.
Dùng sản phẩm này để xác định tính chất hóa lý: ảnh hưởng của các tác nhân (nhiệt độ, pH, ion kim loại), khả năng liên kết cacbohydrate và đặc tính sinh học : khả năng kháng khuẩn.
c. Xác định ảnh hưởng của các tác nhân: nhiệt độ, pH, ion kim loại đến hoạt tính NKHC của lectin
(Yêu cầu: đưa hoạt tính của dịch mẫu về khoảng 26).
Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ
Cho 0,5 -1 ml mẫu dung dịch lectin đun nóng tại những nhiệt độ khác nhau: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 (0C) trong 30 phút, sau đó làm lạnh ngay trong đá và đo lại hoạt tính NKHC để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính NKHC của lectin.
Xác định ảnh hưởng của pH
Cho 0,5 -1 ml mẫu dung dịch lectin thẩm tách với dung dịch đệm ở nhiệt độ phòng, qua đêm với các pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10. Sau đó, thẩm tích ngược lại với NaCl 0,85%.
Phần sau thẩm tích được thu lại và thử hoạt tính NKHC để xác định sự ảnh hưởng của pH đến hoạt tính NKHC của lectin.
Những dung dịch đệm được sử dụng:
Đệm acetate pH: 3, 4, 5 ( acitic acid/ acetat natri)
Đệm phosphate pH: 6, 7 (Na2HPO4.12H2O/ NAH2PO4.2H2O)
Đệm tris HCl pH: 8 (Tris/ HCl)
Đệm carbonate pH: 9, 10 (Na2CO3/ NaHCO3)
Xác định ảnh hưởng của ion kim loại
Cho 0,2 ml dịch mẫu lectin thẩm tích ở nhiệt độ phòng qua đêm với 400 ml dung dịch EDTA 50 mM.
Phần không thẩm tích được thu lại, thử hoạt tính NKHC và so sánh với mẫu đối chứng (không tương tác với EDTA) để xác định sự ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính NKHC của lectin.
2.3.3 Phương pháp phân tích
2.3.3.1 Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu (NKHC) [48] (NKHC) [48]
Chuẩn bị huyền phù hồng cầu (HC) 2% - Lấy máu từ thỏ.
- Cho 20 ml máu vào 2 ml dung dịch chống đông máu bao gồm: C6H5Na3O7.2H2O, NaH2PO4, acid citric C6H8O7.2H2O và dextrose.
- Mẫu máu được rửa từ 3-5 lần với 50 thể tích dung dịch đệm phosphat (PBS 0,02 M; NaCl 0,85%). Sau khi rửa, huyền phù HC 2% được điều chế trong dung dịch đệm phosphat và được dùng như HC tự nhiên.
- Hồng cầu xử lý trypsin được chuẩn bị như sau: 1/10 thể tích của dung dịch trypsin 0,5% (w/v) được cho vào huyền phù HC tự nhiên 2% (v/v) của HC được xử lý trypsin.
+ Rửa hồng cầu bằng NaCl 0,85%: dung dịch muối sinh lý sẽ không làm ảnh hưởng đến HC, giữ HC lâu hơn, rửa sạch HC bị vỡ và bạch cầu.
+ Xử lý HC 2% bằng enzyme: protein cuộn tròn các nhóm carbohydrate ở bên trong nên lectin không thể liên kết được. Enzyme sẽ cắt ngắn mạch protein để lộ các nhóm cacbohydrate, tương tác với lectin.
+ Rửa lại hồng cầu bằng dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M; NaCl 0,85%): nhằm loại bỏ HC tồn tại trên bề mặt tế bào máu và một phần enzyme còn sót lại.
HC được sử dụng trong các thí nghiệm xác định hoạt độ NKHC của lectin là HC thỏ 2% đã xử lý trypsin.
Cách tiến hành
- Cho 25 µl NaCl 0,85% vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy chữ V.
- Thêm 25 µl mẫu dịch lectin cần kiểm tra hoạt độ NKHC vào giếng đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ pha loãng là 1/2n (n: số lần pha loãng). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tiếp tục cho 25 µl hồng cầu thỏ 2% đã xử lý trypsin vào tất cả các giếng. - Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng. Sau 2 giờ, đọc kết quả.
Đọc kết quả
- Kết quả âm tính: tất cả HC lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ. - Kết quả dương tính: HC trong giếng bị ngưng kết hơn 50%.
Đơn vị hoạt độ
1 đơn vị hoạt độ lectin hay 1 đơn vị hoạt độ NKHC trên 1 ml (HU/ml) chính là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà dịch lectin còn có khả năng làm ngưng kết hơn 50% lượng hồng cầu cho vào phản ứng.
Hoạt độ lectin được xác định theo hai chỉ số:
- Hoạt độ tổng số (HĐTS): là tổng số đơn vị hoạt tính có trong một thể tích nhất định. Đơn vị: HU
HĐTS = V. 2n Trong đó: V: tổng thể tích (ml)
n: số lần pha loãng
- Hoạt độ riêng (HĐR): là số đơn vị lectin có trong 1mg protein. Đơn vị: HU/mg
HĐR = HĐTS / Proteintổng Trong đó: HĐTS : tổng số đơn vị hoạt tính
Proteintổng : tổng hàm lượng protein.
- MAC (minimum agglutination concentration): là nồng độ protein nhỏ nhất có khả năng gây ngưng kết HC đã được xử lý Trypsin. Đơn vị: (µg)
MAC = Hàm lượng protein (µg /ml) /2n Trong đó: n: số lần pha loãng
2.3.3.2 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951)
Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp của Lowry và cộng sự năm 1951 [6], dùng Albumin huyết thanh bò (BSA- Bovine serum albumin) làm chất chuẩn.
Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở phức chất đồng - protein khử hỗn hợp photphomolipden photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời. Cường độ màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong phạm vi nhất định. Đo cường độ màu bằng thiết bị đo màu quang điện ở bước sóng 750 nm. Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được hàm lượng protein cần phân tích.
Hóa chất
Thuốc thử A: 20 g Na2CO3 và 4 g NaOH 0,1 M pha trong 1000 ml nước cất. Thuốc thử B: Sodium citrate 1% (1,14 g pha trong 100 ml nước cất).
Thuốc thử C: CuSO4 .5H2O 0,5% (0,5 g pha trong 100 ml nước cất).
Dung dịch hỗn hợp thuốc thử: hỗn hợp của 3 dung dịch A: B: C theo tỉ lệ 50: 1: 1 (yêu cầu pha trước khi sử dụng).
Thuốc thử Folin: pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng. Dung dịch gốc: Albumin huyết thanh bò (BSA) 1 mg/ml.
Xây dựng đường chuẩn
Cân 10 mg BSA hòa tan trong 10ml nước cất, ta được dung dịch gốc có nồng độ 1 mg/ml. Sau đó, pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất thành các nồng độ 10, 20, 40, 60, 80, 100 và 120 µl/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn.
Lấy chính xác 0,5 ml dịch chứa BSA với các nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 ml dung dịch hỗn hợp thuốc, lắc đều để yên trong 20 phút. Sau đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 60 phút. Đem so màu của hỗn hợp ở bước sóng 750 nm. Mẫu trắng (C): thay dịch chứa BSA bằng nước cất, các bước còn lại tiến hành tương tự.
Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi quy.
Mẫu thí nghiệm
Lấy 0,5 ml dịch protein cần kiểm tra cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 ml dung dịch hỗn hợp thuốc, lắc đều để yên trong 20 phút. Sau đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 60 phút. Đem so màu của hỗn hợp ở bước sóng 750 nm.. Mẫu trắng: thay dịch protein bằng nước cất, các bước còn lại tiến hành tương tự. Sau đó, đem so màu ở bước sóng 750 nm. Kết quả được tính dựa vào đường chuẩn protein. Làm thí nghiệm với mẫu kép và lấy giá trị trung bình.
2.3.3.3 Phương pháp khảo sát khả năng liên kết cacbohydrate của lectin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiến hành khảo sát khả năng liên kết cacbohydrate của lectin với một số loại đường và glycoprotein dựa theo [30] được liệt kê trong bảng 2.2
Bảng 2.2: Khảo sát khả năng liên kết cacbohydrate của lectin với một số loại đường và glycoprotein Đường (100 mM) Glycoprotein (2000 µg/ml) D- glucose D- mannose Transferrin Fetuin Yeast mannan Bovine thyroglobulin Porcine stomach mucin
Tiến hành
( Yêu cầu: đưa hoạt tính của dịch mẫu về 23)
- Sử dụng khay 96 giếng đáy chữ V. Cho 25 µl NaCl 0,85% vào các giếng. - Cho 25 µl dung dịch đường hoặc glycoprotein vào giếng số 1 và số 2, rồi
pha loãng 2 lần theo từng hàng bắt đầu từ giếng số 2.
- Cho 25 µl dung dịch lectin vào mỗi giếng. Lắc nhẹ và giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
- Sau 1 giờ, cho 25 µl huyền phù hồng cầu thỏ đã xử lý trypsin vào mỗi giếng. Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng. Sau 2 giờ, đọc kết quả.
Đọc kết quả
- Nếu hoạt độ NKHC của lectin không thay đổi: lectin không có khả năng liên kết với đường hoặc glycoprotein được kiểm tra.
- Nếu hoạt độ NKHC của lectin giảm: lectin đã liên kết với đường hoặc glycoprotein được kiểm tra. Nồng độ nhỏ nhất của đường (mM) hoặc glycoprotein (µg/ml) mà tại đó hiện tượng NKHC do lectin gây ra bị ức chế hoàn toàn (nghĩa là lectin đã liên kết với đường hoặc glycoprotein kiểm tra), được tính theo công thức:
Cmin = C/ HI
Trong đó: Cmin: Nồng độ nhỏ nhất của đường (mM) hoặc glycoprotein (µg/ml) mà tại đó hiện tượng NKHC do lecti gây ra bị ức chế hoàn toàn.
C: Nồng độ đường (mM) hoặc glycoprotein (µg/ml).
HI: Giá trị nồng độ pha loãng mà tại đó hoạt độ NKHC vẫn còn bị ức chế, sau khi lectin đã liên kết với đường hoặc glycoprotein.
2.3.3.4 Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn của lectin
Đánh giá khả năng kháng khuẩn của lectin từ lá tỏi bằng phương pháp khuếch tán trên bề mặt thạch.
Chuẩn bị môi trường thạch
Môi trường sử dụng trong nghiên cứu là môi trường nuôi cấy không chọn lọc MA (Marine Agar), thành phần môi trường bao gồm:
10 g Agar 0,1 g K2HPO4
0,1 g MgSO4.7H2O 1 g dịch chiết nấm men
5 g pepton
1000 ml gồm: 500 ml nước cất + 500 ml nước biển – pH: 6,8 – 7,2
Tiến hành
Chuẩn bị dịch huyền phù của vi khuẩn đã được nuôi cấy qua 24 giờ với mật độ khoảng 109 tế bào/ ml. Trải dịch huyền phù vi khuẩn lên môi trường thạch trong đĩa peptri.
Xử dụng giấy úp lên trên bề mặt môi trường thạch để tạo thành những vòng nhỏ có đường kính khoảng 6 mm.
Nhỏ một lượng dịch lectin nhất định vào tâm vòng giấy trên đĩa thạch. Hoạt chất lectin sẽ khuếch tán trên môi trường thạch, ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn, tạo vòng vô khuẩn.
Ủ đĩa ở 370C, sau 24 giờ, kiểm tra sự tạo thành vòng vô khuẩn, đo đường kính vòng vô khuẩn. Tính kháng khuẩn mạnh hay yếu tùy thuộc vào đường kính vòng vô khuẩn lớn hay nhỏ.
Tiến hành tương tự cho mẫu đối chứng, thay dịch lectin bằng ampicillin và dung dịch đệm phosphate .
Bảng 2.3: Các vi khuẩn dùng trong thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn của lectin từ lá tỏi Kí hiệu Vi khuẩn EC Escherichia Coli T12 Vibrio harveye SA Staphylococcus aureus BC Bacillus cereus SF Streptococcus faecalis PA Pseudomonas aeruginosa T5 Enterobacter cloace 2.2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số liệu thực nghiêm được phân tích thống kê ANOVA, SPSS 16.0 và vẽ đồ thị bằng phần mềm Microsoft office Excel 2007.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Các điều kiện để thu nhận lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.)
3.1.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) đến hoạt độ NKHC của dịch chiết (DC) lectin từ lá tỏi dịch chiết (DC) lectin từ lá tỏi
Tiến hành ngâm chiết lectin từ lá tỏi ta bằng dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85 %NaCl) ở nhiệt độ phòng với thời gian chiết là 6 giờ và tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch đệm phosphate (w/v) thay đổi lần lượt là 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9. Sau đó, lọc qua lưới lọc rồi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 15 phút để loại bã, thu DC. Xác định nồng độ protein nhỏ nhất gây NKHC (MAC), hoạt độ tổng số (HĐTS) và hoạt độ riêng (HĐR) của lectin trong từng DC. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến MAC, HĐTS và HĐR của lectin Mẫu V (ml) Protein (mg) HA (HU/ml) MAC (µg/ml) HĐTS (HU) HĐR (HU.mg-1) 1:5 47 94.94 2 1009 94 0.99 1:6 58 85.26 2 736 116 1.36 1:7 68 72.08 1 1064 68 0.94 1:8 78 72.54 1 927 78 1.08 1:9 88 117.92 1 1336 88 0.75 Chú thích: V: Thể tích dịch chiết
0 20 40 60 80 100 120 140 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9
Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi
H Đ T S ( H U ) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 H Đ R ( H U /mg ) HĐTS (HU) HĐR (HU.mg-1)
Hình 3.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến HĐTS và HĐR của lectin