sativum L.)
Từ những kết quả nguyên cứu trên đã đưa ra quy trình công nghệ thu nhận
Hình 3.5: Sơ đồ quy trình công nghệ thu nhận chế phẩm lectin kỹ thuật từ lá tỏi Loại bã Kết tủa lectin (amonium sunfate 50%) Lá tỏi Cắt nhỏ, xay nhuyễn Cân mẫu Cắt nhỏ, Ngâm chiết Lọc
- Dung môi: Dung dịch đệm
phosphate (PBS 0,02M, 0,85% NaCl) - Nhiệt độ chiết: nhiệt độ phòng
- Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v): 1: 6
- Thời gian chiết: 8 giờ
Chế phẩm lectin kỹ thuật
Loại tủa Hòa tan kết tủa
Ly tâm Thẩm tích Ly tâm Túi thẩm tích Rửa Đun sôi
Thuyết minh quy trình
Cây tỏi (Allium sativum L.) sau thu hoạch tiến hành xử lý, cắt rời củ, lá và rễ.
Lá được cho vào các túi nilong, bảo quản trong tủ đông -200C.
Lá tỏi (bảo quản đông) được cắt nhỏ, xay nhuyễn và cân với khối lượng xác định để chuẩn bị cho quá trình chiết. Tiến hành ngâm chiết lá tỏi trên máy lắc với vận tốc 17 vòng/ phút theo các thông số: dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85% NaCl) ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch đệm phosphate (w/v) là 1:6 và thời gian chiết 8 giờ. Tiếp theo, lọc qua lưới lọc rồi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 15 phút để loại bã, thu DC nhằm chuẩn bị cho quá trình tủa lectin.
Quá trình tủa lectin tiến hành bằng muối amoni sunfate với nồng độ 50%, để qua đêm ở nhiệt độ 180C. Sau đó, ly tâm dịch sau tủa ở 180C với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 10 phút, thu phần kết tủa. Tủa thu được hòa với dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85% NaCl) (lượng ít nhất) đưa về cùng một thể tích. Dịch tủa thu được thẩm tích với dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85% NaCl) với tỷ lệ dịch mẫu: dung dịch đệm phosphate là 1:100 để loại bỏ muối amoni sunfate còn dư trong dịch tủa. Cuối cùng dịch tủa sau thẩm tích được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 10 phút để loại tủa, thu phần dịch trong, đây chính là chế phẩm lectin kỹ thuật.
Chuẩn bị túi thẩm tích: túi thẩm tích cần được đun sôi và rửa bằng nước cất để loại bỏ tạp chất có trong túi
Tiến hành thu nhận chế phẩm lectin kỹ thuật từ lá tỏi theo quy trình đề xuất. Sau đó xác định hàm lượng protein và hoạt độ NKHC, hiệu suất thu hồi lectin.
Bảng 3.4: Kết quả thu nhận chế phẩm lectin kỹ thuật từ lá tỏi (Allium sativum L.) Mẫu V (ml) Protein (mg) HA (HU/ml) MAC (µg/ml) HĐTS (HU) HĐR (HU.mg-1) Độ tinh sạch (lần) Dịch chiết 423 1257.14 4 743.18 1692 1.35 1 Dịch tủa 5.0 78.90 256 61.65 1285 16.29 12.07 Dịch sau thẩm tích 7.0 75.74 512 21.13 3584 47.32 35.05
Chú thích: V: Thể tích dịch tương ứng với từng mẫu Độ tinh sạch = HĐR mẫu / HĐR mẫu dịch chiết (lần)
(b)
Hình 3.6: Hoạt độ NKHC của chế phẩm lectin kỹ thuật từ lá tỏi
(a) Hình ảnh minh họa sự tương tác giữa lectin với hồng cầu thỏ
(b) Kết quả NKHC của chế phẩm lectin kỹ thuật từ lá tỏi (Allium sativum L.)
Chú thích:
L: Mẫu lectin từ lá tỏi ĐC: Mẫu đối chứng
Kết quả bảng 3.5 cho thấy độ tinh sạch của các mẫu thu qua từng giai đoạn tăng dần. Dịch tủa có số lần tinh sạch là 12,7. Nguyên nhân vì sau công đoạn tủa, đã tiến hành kết tủa chọn lọc protein lectin và kèm theo các protein khác có khối lượng phân tử thấp (vì tiến hành tủa bằng amonium sunfate 50%). Sau đó, để đảm bảo loại sạch aminoum sunfate còn sót lại ở dịch tủa và những protein có khối lượng phân tử dưới 10 kDa, công đoạn thẩm tích được tiến hành và thu được độ tinh sạch cao hơn so với dịch chiết thô ban đầu (35,05 lần).
L
ĐC HA
Như vậy, từ bảng 3.5 và hình 3.5 cho thấy, dịch sau thẩm tích (chế phẩm lectin kỹ thuật) có hoạt độ NKHC là 29, hoạt độ riêng là 47,32 HU/mg và hoạt độ tổng số là 3584 HU, nồng độ protein nhỏ nhất gây NKHC là 21,13 µg/ml và độ tinh sạch là 35.05 lần.
3.2 Xác định tính chất hóa lý và đặc tính sinh học của lectin từ lá tỏi (Allium
sativum L.)
3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi
Để khảo sát nhiệt độ tối ưu của lectin từ lá tỏi, lectin sẽ được xử lý ở các mức độ nhiệt độ khác nhau từ 200C đến 1000C trong vòng 30 phút, sau đó làm lạnh nhanh và xác định hoạt độ NKHC của lectin với HC thỏ đã được xử lý trypsin.
Kết quả được trình bày trong hình 3.7.
0 10 20 30 40 50 60 70 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Nhiệt độ H o ạt đ ộ N K H C ( H .U /m l) Hoạt độ NKHC (H.U/ml)
Hình 3.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi
Ở nhiệt độ 200C hoạt độ NKHC của lectin đạt cực đại. Khi tăng dần nhiệt độ từ 20 đến 500C thì hoạt độ của lectin vẫn không thay đổi (64 HU/ml). Nhưng, khi nhiệt độ vượt quá 6 0C thì hoạt độ NKHC bắt đầu giảm dần. Ở nhiệt độ 800C, hoạt độ NKHC của lectin chỉ còn 4 HU/ml. Nguyên nhân có thể là do nhiệt độ tăng cao làm đứt gãy một số liên kết yếu trong phân tử lectin, làm thay đổi cấu trúc của phân
tử này, dẫn đến trung tâm hoạt động của phân tử lectin hoạt động giảm dần. Trung tâm hoạt động của phân tử lectin có khả năng liên kết với cacbohydrat trong các thụ thể tiếp nhận trên các bề mặt tế bào và nhờ liên kết này mà lectin đã kết dính với các tế bào, tạo hiện tượng ngưng kết tế bào [8]. Do đó, khi cấu trúc phân tử lectin thay đổi sẽ làm giảm dần khả năng liên kết với các glycoprotein trên bề mặt tế bào, cụ thể là tế bào hồng cầu thỏ, từ đó làm ảnh hưởng đến khả năng NKHC của lectin. Vậy, theo kết quả nghiên cứu, lectin từ lá tỏi không bị thay đổi hoạt tính khi được đun nóng ở 500C trong 30 phút. Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Fatima, Yeldur (2010) về sự ổn định và miễn dịch của 2 loại lectin (ASA I và ASA II) trong
tỏi (Allium sativum) cho thấy: ASA I ổn định hoạt tính ở 600C trong 30 phút, giảm dần ở 800C và mất hẳn ở 1000C; ASA II ổn định ở 400C, giảm dần ở 600C và mất hẳn ở 800C [24].
Lectin từ mít na cũng cho kết quả tương tự lectin lá tỏi, ở mức nhiệt độ 60°C thì hoạt độ NKHC giảm 50% và mất dần ở 70°C [1]. Theo kết quả của Cynthia và cộng sự (2013), sau khi tinh chế bằng phương pháp mới, các lectin từ dầu thô của
hạt Cratylia Mollis có hoạt độ NKHC ổn định cho đến 60°C, sau đó giảm mạnh ở
80°C (512-128 HU) [20]. Và khi nghiên cứu tinh sạch và một số tính chất của lectin
từ nước ép cà chua (Lycopersicon esculentum), David (1980) cũng nhận thấy hoạt
độ NKHC của lectin này ổn định ở 650C [22].
Nghiên cứu của Hùng L.D. và cộng sự (2011) về lectin đặc hiệu N- glycan
dạng giàu mannose từ 3 loại rong Kappaphycus sttriatum và Eucheuma
denticulatum cho thấy hoạt tính của chúng không bị thay đổi khi được gia nhiệt ở
600C trong 30 phút và mất hoàn toàn hoạt tính NKHC ở 900C [30].
Xét về khả năng bền nhiệt của lectin từ lá tỏi ở 500C và tại 80- 1000C dù giảm mạnh nhưng vẫn còn hoạt tính NKHC (4 HU/ml) đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu cũng như ứng dụng lectin từ lá tỏi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
3.2.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi
Để tìm ra khoảng pH tối ưu của lectin từ lá tỏi, tiến hành thẩm tích lectin qua đêm ở nhiệt độ phòng với các loại đệm có pH khác nhau từ 3 đến 10. Sau đó, tiến hành thẩm tích một lần nữa với NaCl 0,85% để loại bỏ sự ảnh hưởng của pH với hồng cầu thỏ đã được xử lý trypsin .
Kết quả xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi được trình bày trong hình 3.7.
0 10 20 30 40 50 60 70 3 4 5 6 7 8 9 10 pH H o ạ t đ ộ N K H C ( H .U /m l) Hoạt độ NKHC (H.U/ml)
Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi bị ảnh hưởng bởi sư thay đổi của pH, ở 2 môi trường axit và kiềm.
Ở môi trường trung tính, hoạt tính NKHC của lectin từ lá tỏi ta rất ổn định (64 HU/ml) nhưng tại môi trường axit (pH 3-5) và kiềm (pH 9- 10), hoạt độ giảm một nửa (32 HU/ml). Điều này có thể giải thích là vì ở những pH này, lực đẩy tĩnh điện sẽ dễ dàng làm giãn mạch các cấu trúc protein lectin bậc 2 và 3, gây biến tính các protein lectin này, từ đó làm giảm hoạt tính sinh học. Kết quả này tương tự với
(2010), hoạt tính NKHC của ASAI cũng ảnh hưởng bởi môi trường axit và kiềm, trong đó pH 2- 4 gây giảm hoạt tính mạnh hơn pH 8-10 [24].
Theo nghiên cứu của TS. Trương Văn Châu, hoạt độ NKHC của lectin từ mít
na Artocarpus melinoxylus đạt tối ưu trong khoảng pH từ 6,5 đến 8, trong khoảng
pH từ 4 đến 6 hay từ 8 đến 10 khả năng NKHC của lectin giảm mạnh hoặc mất
hoàn toàn [1]. Lectin từ hạt đậu đỏ tây (Phaseolus Vulgais) cho hoạt độ cao trong vùng pH = 7: 8 [3]. Lectin từ hạt chay (A. tonkinensis) hoạt động mạnh nhất ở vùng
pH 8,6 và mất hẳn hoạt độ ở pH 9,5 [5].
So sánh với lectin từ rong biển, hầu hết hoạt độ NKHC của lectin này đều
không bị ảnh hưởng bởi pH, tiêu biểu như rong Ulva pertusa hoạt tính ổn định trong khoảng pH 3- 10 và rong Enteromorpha linza không thay đổi hoạt độ trong
khoảng ph 4-10 [46]. Ngoài ra, khi nghiên cứu tinh sạch và đặc tính của một lectin
ngoại bào (lectin I) từ vi khuẩn Agrobacterium radiobacter NCIM 2443,
Bhagyashree và cộng sự (1997) cho thấy lectin I ổn định ở pH 5 [17].
Như vậy, đối với letin từ thực vật bật cao, khoảng tối ưu của cho hoạt độ NKHC là ở môi trường trung tính, axit yếu và kiềm yếu. Xét về khoảng tối ưu, lectin từ lá tỏi ta cũng nằm trong phạm vi này nhưng, nó có một đặc điểm khác biệt là ở pH 3-5 và pH 9-10 hoạt độ NKHC chỉ giảm một nửa mà không mất hoàn toàn. 3.2.3 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi
Để đánh giá ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính NKHC của lectin từ lá tỏi, tiến hành thẩm tích ở nhiệt độ phòng qua đêm với 400 ml dung dịch EDTA 50 mM. Phần không thẩm tách được thu lại, thử hoạt tính NKHC và so sánh với mẫu đối chứng (không tương tác với EDTA) để xác định sự ảnh hưởng của ion kim loại đến lectin từ lá tỏi. Kết quả được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5: Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi Hoạt độ NKHC
Mẫu
HU/ml %
Đối chứng 64 100
Từ kết quả bảng 3.5, mặc dù ngiên cứu chỉ khảo sát sự sảnh hưởng của EDTA đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi ta nhưng đã cho thấy: sự có mặt của ion kim loại không làm thay đổi khả năng NKHC. EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid) là một axít hữu cơ mạnh và có khả năng tạo phức với kim loại, cụ thể là lấy ion kim loại ra khỏi cấu trúc lectin. Mẫu lectin sau khi thẩm tích với EDTA được kiểm tra hoạt tính cho kết quả không đổi so với mẫu đối chứng (64 HU/ml).
Kết quả nghiên cứu của David , M.M. Yeoman (1978) đã công bố: letin chiết từ hạt cây cà độc dược Datura không bị ảnh hưởng bởi ion kim loại đến hoạt độ NKHC [21]. Vào năm 1979, David tiếp tục chỉ ra rằng lectin từ nước cà chua không bị ảnh hưởng bởi EDTA [22]. Trong khi đó, nghiên cứu tách một lectin mới (cMoL) từ hạt giống cây đậu dại (chùm ngây), Andre và cộng sự (2009) nhận thấy sự tồn tại của các ion Mg2+ ,Ca2+ và K+ làm tăng tăng hoạt độ NKHC của cMoL [11]. Lectin từ hạt đậu đỏ tây cũng bị ảnh hưởng các cation Ba2+ , Cu2+ , Mg2+ ,Ca2+ và cation Cu2+ là ảnh hưởng mạnh nhất vì ở nồng độ thấp nhất (0,0625 M) đã có tác dụng làm tăng hoạt độ của lectin [3].
Vậy, lectin từ lá tỏi không bị ảnh hưởng bởi ion kim loại sẽ là một tính chất đem lại thuận lợi cho việc nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
3.2.4 Khả năng liên kết cacbohydrate của lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.)
Khảo sát khả năng liên kết cacbohydrate của lectin từ lá tỏi với một số loại đường và glycoprotein bằng cách: cho lectin tương tác với đường hoặc glycoprotein với các nồng độ khác nhau trong vòng 60 phút. Sau đó, tiến hành bổ sung hồng cầu thỏ đã xử lý trypsin vào hỗn hợp trên để đánh giá khả năng gây ức chế hoạt độ NKHC của lectin. Từ đó, tìm ra được giá trị nồng độ nhỏ nhất của đường hoặc glycoprotein mà lectin có thể liên kết được. Giá trị này được tính theo công thức đã được đề cập tới ở mục 2.3.3.3. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6 và hình 3.9.
Bảng 3.6: Nồng độ đường và glycoprotein nhỏ nhất có khả năng ức chế hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi.
Mẫu HI Cmin (mM, µg/ml) D- Mannose - - Đường (100mM) D- Glucose - - Transferrin - - Fetuin - - Yeast mannan 24 6.25 Bovine thyroglobulin 23 25 Glycoprotein (2000µg/ml)
Porcine stomach mucin - -
Chú thích: “-“: Đường 100 mM và glycoprotein 2000 µg/ml không có khả năng gây ức chế hoạt độ NKHC của lectin.
(a1)
Porcine stomach mucin
Yeast mannan
Fetuin
Transferrin HI =
(a2)
(b)
Hình 3.9: Khả năng liên kết cacbohydrate của lectin từ lá tỏi
(a1, a2) Kết quả khả năng liên kết cacbohydrate của lectin từ lá tỏi (b) Hình ảnh minh họa sự tương tác giữa lectin với cacbohydrate
HI = 23 Bovine thyroglobulin
D- Mannose
Theo kết quả từ bảng 3.6, hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi không bị ức chế bởi hai loại đường được kháo sát. Nghĩa là lectin không có khả năng liên kết với D-
Mannose và D-Glucose. Kết quả này khác với lectin chiết từ hạt Lonchocarpus
Capassa (apple-leaf), Francois và cộng sự (1986) đã cho thấy lectin này liên kết D-
Mannose và D-Glucose với Cmin là 4 mM [25]. Nhưng lại tương đồng với với kết quả của Phan Thị Việt Hà (2011) về lectin từ hạt đậu đỏ [3], hay nghiên cứu của
Trần Thị Long, Nguyễn Quốc Khang (1996) về lectin từ hạt chay (A. tonkinensis)
đối với hai loại đường này [5].
Trong khi đó, khảo sát khả khả năng liên kết glycoprotein của lectin cho kết quả 3/5 glycoprotein mà lectin không liên kết, cụ thể là Transferrin, Fetuin và Porcine stomach mucin. Hai glycoprotein còn lại liên kết với lectin với nồng độ khác nhau. Bovine thyroglobulin (25 µg/ml) có khả năng làm ức chế hoạt độ NKHC của lectin vơí nồng độ cao hơn Yeast mannan (6,25 µg/ml ).
Theo Andréa và cộng sự (2009), khác với lectin từ lá tỏi, lectin chiết từ mô lá cây đậu dại có khả năng liên kết với Fetuin [11]. Tuy nhiên, kết quả này có có điểm
tương đồng với lectin chiết từ rong đỏ K. striatum về khả năng liên kết với Yeast
mannan và Bovine thyroglobulin nhưng với nồng độ gây ức chế nhỏ hơn lectin từ lá
tỏi (Allium sativum L.) [9].
Ngược lại với lectin từ rong biển, hầu hết tương tác với glycoprotein. Các lectin thu nhận từ thực vật bậc cao lại có khả năng tương tác mạnh với các loại đường đơn [30], nên cần mở rộng phạm vi thử nghiệm liên kết các loại đường đơn cho lectin từ lá tỏi để có kết quả bao quát hơn, kể cả với glycoprotein.
Tìm hiểu cấu trúc của glycoprotein tương tác mạnh với lectin trong thí nghiệm trên cho thấy, Yeast mannan có cấu trúc lõi là oligo- saccharide N-glycan dạng high-mannose. Từ đó có thể thấy rằng, lectin từ lá tỏi có tính đặc hiệu tương đôí cao với glycoprotein N-glycan dạng high-mannose. Đây là dạng glycoprotein xuất hiện xuất hiện nhiều trên lớp vỏ của hầu hết các virus gây bệnh, đặc biệt là HIV và HBV [30]. Theo nghiên cứu của Koen Smeet và cộng sự (1993) về nhân bản và đặc tính của các dòng vô tính lectin cDNA từ hành tây, hẹ và tỏi tây cho thấy
các lectin từ hẹ (A. ascalonicum) và tỏi tây (A. porrum) có hoạt tính kháng virus đáng kể khi thử nghiệm chống lại HIV-1 và HIV-2, trong khi tỏi thuộc loài A.