(NKHC) [48]
Chuẩn bị huyền phù hồng cầu (HC) 2% - Lấy máu từ thỏ.
- Cho 20 ml máu vào 2 ml dung dịch chống đông máu bao gồm: C6H5Na3O7.2H2O, NaH2PO4, acid citric C6H8O7.2H2O và dextrose.
- Mẫu máu được rửa từ 3-5 lần với 50 thể tích dung dịch đệm phosphat (PBS 0,02 M; NaCl 0,85%). Sau khi rửa, huyền phù HC 2% được điều chế trong dung dịch đệm phosphat và được dùng như HC tự nhiên.
- Hồng cầu xử lý trypsin được chuẩn bị như sau: 1/10 thể tích của dung dịch trypsin 0,5% (w/v) được cho vào huyền phù HC tự nhiên 2% (v/v) của HC được xử lý trypsin.
+ Rửa hồng cầu bằng NaCl 0,85%: dung dịch muối sinh lý sẽ không làm ảnh hưởng đến HC, giữ HC lâu hơn, rửa sạch HC bị vỡ và bạch cầu.
+ Xử lý HC 2% bằng enzyme: protein cuộn tròn các nhóm carbohydrate ở bên trong nên lectin không thể liên kết được. Enzyme sẽ cắt ngắn mạch protein để lộ các nhóm cacbohydrate, tương tác với lectin.
+ Rửa lại hồng cầu bằng dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M; NaCl 0,85%): nhằm loại bỏ HC tồn tại trên bề mặt tế bào máu và một phần enzyme còn sót lại.
HC được sử dụng trong các thí nghiệm xác định hoạt độ NKHC của lectin là HC thỏ 2% đã xử lý trypsin.
Cách tiến hành
- Cho 25 µl NaCl 0,85% vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng đáy chữ V.
- Thêm 25 µl mẫu dịch lectin cần kiểm tra hoạt độ NKHC vào giếng đầu tiên, trộn đều, pha loãng sang các giếng tiếp theo với tỷ lệ pha loãng là 1/2n (n: số lần pha loãng).
- Tiếp tục cho 25 µl hồng cầu thỏ 2% đã xử lý trypsin vào tất cả các giếng. - Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng. Sau 2 giờ, đọc kết quả.
Đọc kết quả
- Kết quả âm tính: tất cả HC lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ. - Kết quả dương tính: HC trong giếng bị ngưng kết hơn 50%.
Đơn vị hoạt độ
1 đơn vị hoạt độ lectin hay 1 đơn vị hoạt độ NKHC trên 1 ml (HU/ml) chính là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà dịch lectin còn có khả năng làm ngưng kết hơn 50% lượng hồng cầu cho vào phản ứng.
Hoạt độ lectin được xác định theo hai chỉ số:
- Hoạt độ tổng số (HĐTS): là tổng số đơn vị hoạt tính có trong một thể tích nhất định. Đơn vị: HU
HĐTS = V. 2n Trong đó: V: tổng thể tích (ml)
n: số lần pha loãng
- Hoạt độ riêng (HĐR): là số đơn vị lectin có trong 1mg protein. Đơn vị: HU/mg
HĐR = HĐTS / Proteintổng Trong đó: HĐTS : tổng số đơn vị hoạt tính
Proteintổng : tổng hàm lượng protein.
- MAC (minimum agglutination concentration): là nồng độ protein nhỏ nhất có khả năng gây ngưng kết HC đã được xử lý Trypsin. Đơn vị: (µg)
MAC = Hàm lượng protein (µg /ml) /2n Trong đó: n: số lần pha loãng