- Ngộ ựộc do ký sinh trùng:
3. đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.3. Phương pháp xét nghiệm vi khuẩn
* định danh vi khuẩn bằng máy Vitek32
Máy Vitek 32 là một hệ thống ựiều khiển bằng bộ vi xử ký ựiện tử, hoạt ựộng hoàn toàn tự ựộng, có khả năng ựịnh danh hơn 300 loại vi khuẩn khác nhau và thực hiện các test kháng sinh ựồ ựối kháng với nhiều loại kháng sinh.
Hệ thơng Vitek có 2 phần chắnh gồm: modul phần cứng và bộ card chứa hố chât có sẵn..Modul phần cứng gồm bộ phận bơm mẫu, bộ phận ựọc và ủ, bộ phận kiểm soát trung tâm, máy so mầu, máyin, nguồn lưu ựiện.Card chứa hố chất có sẵn, kắch thước bằng thẻ tắn dụng gồm 30 Ờ 45 khe rất nhỏ phân phối cơ chất ựể ựịnh danh vi khuẩn hoặc kháng sinh làm tesr kháng sinh ựồ. Bộ card ựịnh danh ựược công thức hoấ bởi các tác nhân sinh hoá ựặc biệt phù hợp với nghiên cứu. Card ựịnh danh chứa
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 41
ựựng hố chất ựảm bảo thực hiện 30 phản ứng sinh vật hoá học. Card xác ựịnh kháng sin ựồ có thể phủ ắt nhất 10 loại kháng sinh cô ựặc ựã lựa chọn.
Nguyên lý hoạt ựộng: Mày Vitek hoạt ựộng nhờ hệ thống quang học tự ựộng quét quá trình phát triển ựộng học của vi khuẩn. Các phanr ứng sinh học xảy ra trong bộ card chứa hố cất có sẵn sau mỗi giờ. Căn cứ vào hệ thống các phản ứng sinh học, phần mềm của máy tắnh phân tắch ựịnh danh vi khuẩn và ghi lại kết quả.
Các bước xác ựịnh vi khuẩn bằng máy Vitek: Chuẩn bị chủng vi khuẩn:
Vi khuẩn cần ựịnh danh phải thuần nhất, tưc là chọn khuẩn lạc tách biệt trên mội trường agar thắch hợp.
Vi khuẩn ựược nuôi cấy trên ựĩa thạch 18 Ờ 24 giờ; nhuộm gram hoặc thử KOH 0,3% trươc khi chọn card ựịnh danh cho phù hợp.
Nếu vi khuẩn là Gram (+), sử dụng card GPI (Gram Positive Identification); nếu vi khuẩn là Gram (- ), sử dụng card GNI (Gram Negative Identification).
- đánh số card:
Với vi khuẩn Gram âm, làm phản ứng oxydaza: nhỏ một giọt nước sinh lý lên phiến kắnh rồi trộn ựều với một khuẩn lạc ựiển hình. Dùng giấy tẩm oxydaza ựặt lên trên hỗn dịch, nếu xuât hiện màu xanh tắm là phản ứng dương tắnh, không chuyển màu là phản ứng âm tắnh. Trường hợp phản ứng dương tắnh ựánh dấu vào ô O trên card GNI, âm tắnh thì khơng ựánh dấu vao ơ ựó.
Với vi khuẩn Gram ựương, làm phản ứng catalaza: nhỏ một giọt H2O2 lên phiến kắnh, lấy một khuẩn lạc ựiển hình trộn ựều. Nếu không thất hiện tượng gì khác thường thì phản ứng âm tắnh, nếu có hiện tượng sủi bọt (trong thời gian 5 Ờ 10 phút) là phản ứng dương tắnh (thời gian vượt quá 10 phút có thể là dương tắnh giả).
Trường hợp phản ứng catalaza dương tắnh thì ựánh dấu vào ô O trên card GPI. Sau ựó làm tiếp phản ứng ựơng huyết tương, phản ứng dương tắnh, ựánh dấu vào ô bầu dục phắa dưới.
Nếu phản ứng catalaza âm tắnh ựể trống ơ ựó và làm tiếp phản ứng dung huyết β- hemolyzit. Khi phản ứng dung huyết β- hemolyzit dương ắnh thì ựánh dấu vào ô bầu dục ở phắa dưới, phản ứng âm tắnh ựể trống.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 42
Cho vào ống nghiệm 1,8 ml dung dịch NaCl 0,85% bằng xi kanh chuẩn hoá Kiểm tra ựộ trong suốt của ống nghiệm chứa nước muối trên máy colorimeter, ựiều chỉnh ở hai mức 0%T và 100% T, sau ựó cho vi khuẩn vào ống (tuỳ loại card mà cho lượng vi khuẩn thắch hợp).
Chọn 1- 2 khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa nước muối sinh lý. đối với card GPI nồng ựộ vi khuẩn trên máy colorimeter ựạt 80 - 88%T (vạch ựỏ). đối với card GNI nồng ựọ vi khuẩn trên máy colorimeter ựạt tõ 67 - 77%T (vạch xanh da trời).
- Nạp vi khuẩn vào card Nối ống hút vào card
Ấn chặt lỗ card ở bên sườn, cầm ống hút vào ống nghiệm chứa vi khuẩn theo ựúng thứ tự card ựịnh danh.
đặt card và ống nghiệm lên giá ựỡ, ựặ ựúng chiều sao cho miệng ống hút sát với ựáy ống nghiệm mới hút ựủ lượng vi khuẩn vào card và không tạo thành bọt khắ trong card.
Cho tồn bộ mày hút chân khơng của máy Vitek. Máy tự ựộng hút vi khuẩn vào card sau 2 Ờ 3 phút
Sau ựó rứt bỏ ống hút, nút lỗ card bằng nút nhựa rồi ựưa vào máy ựọc. - Kiểm tra card trong máy ủ:Từ màn hình chắnh, nhấn Vitek, Chọn Reader 1 - đọc kết quả: thông thường máy tự ựộng ựọc và ựưa ra kết quả nếu %Id > 80%.. Máy sẽ tự ựộng cho biết loài vi khuẩn và tự ựộng chuyển sang phần mềm quản lý Bio - Lasion.
Chuyển ựổi kết quả: tất cả các card chỉ có giá trị khi còn trong máy, nếu bỏ card ra mà chưa chuyển sang chế ựộ Trans, kết quả sẽ bị mất. Do ựó chỉ bỏ card ựịnh danh ra ngoài khi ựã chuyển kết quả sanh chế ựộ Trans.
* Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban ựầu và các dung dịch pha loãng:
Chuẩn bị mẫu thịt: Cân 25g thịt ựã bỏ mỡ, bạc nhạc, cắt nhỏ vào túi dập mẫu ựổ thêm 225ml dung dịch Buffer Pepton, cho vào máy dập mẫu khoảng 2 phút. Mẫu trong túi có ựộ pha lỗng 10-1. Tiếp tục pha lỗng mẫu với các nồng ựộ 10-2, 10-3, 10-4,.... Tuỳ theo mức ựộ ựánh giá ô nhiễm ựể xác ựịnh mức pha lỗng.
Trường đại học Nơng nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 43
trước khi phân tắch. Khi cần thiết (tuỳ theo ựộ sạch bẩn), mẫu cần ựược pha loãng thập phân ựể có ựược các ựộ pha lỗng cần thiết. Hút 25ml nước cho vào bình tam giác chứa 225ml dung dịch Buffer Pepton, lắc ựều. Dung dịch thu ựược có ựộ pha loãng là 10-1 so với ban ựầu. Tiếp tục pha loãng mẫu với các nồng ựộ cần thiết tiếp theo.
3.4.3.1. Xét nghiệm tổng số vi khuẩn hiếu khắ
Phương pháp xác ựịnh tổng số vi khuẩn hiếu khắ : TCVN 5667: 1992.
Nguyên lý: trên môi trường thạch PCA, ở ựiều kiện hiếu khắ, nhiệt ựộ 370C, sau 24h, mỗi khuẩn lạc phát triển riêng rẽ là một ựiểm xuất phát của một tế bào vi khuẩn và ựược biểu diễn dưới dạng số ựơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU: Colony Forming Unit) trong một ựơn vị khối lượng thực phẩm.
Nuôi cấy: Mỗi mẫu xét nghiệm phải nuôi cấy ở 3 ựậm ựộ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng ựộ pha loãng ựược cấy vào 2 ựĩa Petri ựường kắnh 9cm ựã ựược sấy tiệt trùng, mỗi ựĩa 1ml. Rót 15ml mơi trường PCA ở 450Cổ0,50C vào mỗi ựĩa. Trộn cẩn thận mẫu cấy với môi trường. đặt các ựĩa trên mặt phẳng ngang cho thạch ựộng ựặc. Lật ngược các ựĩa và ựưa vào nuôi trong tủ ấm ở 300C trong 72hổ3h.
Tắnh kết quả: đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên các ựĩa sau khi ủ. Chọn các ựĩa có số ựếm từ 25 ựến 250 ựể tắnh kết quả. Mật ựộ tổng số vi khuẩn hiếu khắ trong 1g hay 1ml mẫu ựược tắnh như sau:
d n n C N ) 1 , 0 ( 1+ 2 = ∑ Trong ựó:
N: là số tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu.
∑C
: là tổng số khuẩn lạc ựếm ựược trên tất cả các ựĩa ựã chọn. n1: là số ựĩa ựược giữ lại ở ựộ pha loãng thứ 1
n2: là số ựĩa ựược giữ lại ở ựộ pha loãng thứ 2
d: là hệ số pha loãng tương ứng với ựộ pha loãng thứ nhất
3.4.3.2. Xét nghiệm vi khuẩn E.coli, Coliform bằng phương pháp MNP (Most Probable Number)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 44
Phương pháp phát hiện và tắnh số Coliform và E.coli: lấy mẫu và chuẩn bị mẫu theo tiêu chuẩn 4833 -1:2002 và TCVN 4833 -2:2002. Quy ựịnh chỉ tiêu Theo TCVN 7046 Ờ 2002
Nguyên tắc: Mẫu ựược pha loãng thành một dãy thập phân kế tiếp nhau ựược ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thắch hợp có ống durham. Mỗi nồng ựộ pha loãng ựược ủ trong 3 ống lặp lại. Xác ựịnh ống dương tắnh qua theo dõi sự sinh hơi và ựổi màu trong từng ống nghiệm. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tắnh ở mỗi nồng ựộ pha loãng, tra bảng MNP ựể suy ra số lượng vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g hay 1ml mẫu ban ựầu.
Nuôi cấy: Chuẩn bị dịch ựồng nhất mẫu hoặc pha loãng mẫu thành dãy thập phân liên tiếp.
Cấy và ủ mẫu vào môi trường Lauryl sulfat: LT): Mỗi nồng ựộ pha loãng cấy vào 3 ống canh thang LT, cấy ở 3 ựộ pha loãng liên tiếp.
Trộn cẩn thận chất cấy và môi trường. Ủ các ống nghiệm ựã ựược cấy mẫu trong tủ ấm ở 370C/ 24h ựể xác ựịnh Coliform, trong 24hổ2h ựến 48hổ2h ựể xác
ựịnh E.coli. đếm số lượng các ống LT cho kết quả dương tắnh ở mỗi ựộ pha loãng. để xác ựịnh Ecoli cần thực hiện tiếp:
Cấy chuyển và ủ môi trường EC: Cấy chuyển một vòng que cấy từ mỗi ống nghiệm LT dương tắnh sang mỗi ống nghiệm ựựng canh thang EC, ủ ở 440C trong 24hổ2h ựến 48hổ2h. đếm số lượng các ống EC cho kết quả dương tắnh ở mỗi ựộ pha loãng. Các ống dương tắnh trong môi trường EC ựược cấy chuyển sang môi trường nước pepton ựể kiểm tra sự sinh Indol hoặc cấy trực tiếp lên thạch LEMB ựể kiểm tra sự sinh ánh kim.
Cấy và ủ môi trường nước pepton:
Cấy một vòng que cấy canh khuẩn từ mỗi ống nghiệm EC dương tắnh sang mỗi ống nghiệm ựựng 5-10ml nước pepton, ủ ở 440C trong 48hổ2h. Sau ựó kiểm tra sự sinh khắ Indol.
Kiểm tra sự sinh Indol:
Thêm 0,5ml thuốc thử Indol vào các ống nghiệm chứa nước pepton ựã ựược ủ, trộn kỹ và kiểm tra sau 1 phút. Nếu xuất hiện màu ựỏ pha cồn chứng tỏ là có mặt
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 45
Indol. Ghi nhận số lượng các ống nghiệm có E.coli dương tắnh ở mỗi ựộ pha loãng của mẫu.
Tắnh kết quả:
Các ống môi trường CLP nuôi cấy ở nhiệt ựộ 370C/24h, mơi trường từ hồng ựỏ sang vàng thì ựược coi là dương tắnh ựể tắnh Coliform. Các ống có sự sinh khắ
trong ống nghiệm ựựng canh thang EC và sinh Indol trong ống nước pepton thì ựược coi là dương tắnh.
Từ số lượng các ống nghiệm có E.coli, Coliform dương tắnh ở mỗi ựộ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN thắch hợp (bảng 3x3) ựể tắnh số E.coli trong mẫu và ựược biểu diễn dưới dạng MNP/g hay MNP/ml mẫu ban ựầu.
3.4.3.3. Xét nghiệm vi khuẩn Salmonella
Nguyên lý: Quy trình phát hiện Salmonella cần qua 4 giai ựoạn kế tiếp nhau.
(1) Tăng sinh sơ bộ mẫu ựã ựược ựồng nhất (370C trong 18hổ2h) ựể ựảm bảo phát hiện một lượng nhỏ Salmonella hoặc Salmonella ựã bị suy giảm hoạt tắnh. (2) Tăng sinh chọn lọc ở môi trường Rappaport-Vassiliadis (RVS) và môi trường Muller- Kauffmann. (3) Phân lập: nhằm tách và nhận dạng Salmonella khỏi các quần thể vi sinh vật khác trong mẫu. Nhiều loại môi trường rắn khác nhau ựược sử dụng ựể phân lập Salmonella như Deoxycholat Lyzin Xyloza (XLD), Bitsmut Sulfit (BS),
Brilliant Green (BGA), mỗi môi trường giúp nhận dạng các loài thuộc giống này dựa trên một vài ựặc tắnh (4) Khẳng ựinh: Từ mỗi ựĩa chọn ra ắt nhất 1 khuẩn lạc ựiển hình ria cấy trên bề mặt thạch dinh dưỡng ựể các khuẩn lạc phân lập phát triển tốt. Sử dụng các chủng cấy thuần khiết ựể khẳng ựịnh bằng phép thử sinh hóa và huyết thanh học.
Tiến hành:
Tăng sinh sơ bộ: Lấy phần mẫu thử trong dung dịch ựệm pepton ủ ở 370C trong 18hổ2h.
Tăng sinh chọn lọc: Chuyển 0,1ml dịch tăng sinh thu ựược vào ống chứa 10ml RSV, ủ ở 41,50Cổ10C trong 24hổ3h. Chuyển 1ml dịch tăng sinh thu ựược vào ống chứa 10ml MKTTn, ủ ở 370Cổ10C trong 24hổ3h.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 46
và môi trường ựổ ựĩa thứ hai. Lật ngược các ựĩa sao cho ựáy hướng lên trên, ựặt trong tủ ấm ở 370C trong 24hổ3h. đọc kết quả: trên môi trường XLD khuẩn lạc Salmonella có tâm màu ựen và vùng trong màu ựỏ nhạt do sự thay ựổi màu của chất chỉ thị.
Khẳng ựịnh: Lấy từ mỗi ựĩa của từng môi trường chọn lọc ắt nhất 1 khuẩn lạc
ựiển hình ria cấy lên bề mặt thạch dinh dưỡng ựã ựược làm khô, sao cho các khuẩn lạc phân lập tốt phát triển ựược. Ủ các ựĩa ựã cấy ở 370Cổ10C trong 24hổ3h. Sử dụng các chủng cấy thuần khiết ựể khẳng ựịnh bằng phép thử sinh hóa và huyết thanh.
Khẳng ựịnh sinh hóa: Thạch TSI: Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch và cấy ựâm sâu xuống ựáy. Ủ ở 370Cổ10C trong 24hổ3h.
Thạch ure: Cấy ria trên bề mặt nghiêng của thạch. Ủ ở 370Cổ10C trong 24hổ3h và kiểm tra thường xuyên. Nếu phản ứng dương tắnh thì sự phân giải ure thành amoniac và làm cho phenol màu ựỏ chuyển thành màu hồng và sau ựó chuyển thành ựỏ hồng. Phản ứng thường xuất hiện sau 2-4h
Môi trường phản ứng Indol: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống chứa 5ml môi trường trypton/tryptophan. Ủ ở 370Cổ10C trong 24hổ3h. Sau khi ủ thêm 1ml thuốc thử Kovacs. Nếu xuất hiện vòng màu ựỏ, phản ứng dương tắnh. Nếu xuất hiện vòng màu nâu vàng, phản ứng âm tắnh.
Khẳng ựịnh huyết thanh: Việc phát hiện sự có mặt của Samonella kháng
nguyên O, kháng nguyên Vi và kháng nguyên H ựược thử bằng sự ngưng kết trên phiến kắnh với huyết thanh thắch hợp, từ các khuẩn lạc thuần khiết và sau khi các chủng có thể tự ngưng kết ựã bị loại trừ.
Bảng 3.1 Tổng hợp nhận ựịnh tắnh sinh hoá của vi khuẩn Salmonella
STT Tắnh chất sinh hoá Kết quả thử nghiệm
1 TSI lactos -
2 TSI sucros -
4 TSI glucos +
5 TSI glucos sinh hơi +
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 47
STT Tắnh chất sinh hoá Kết quả thử nghiệm
7 Phân giải urê -
8 Lysin decacboxylas +
9 B-Galactosidas (O.N.P.G) -
10 Phản ứng VP -
11 Phản ứng Indol -
3.4.3.4. Xét nghiệm vi khuẩn ựể phát hiện và tắnh số lượng vi khuẩn Staphylococcus aureus có trong 1 gram thịt lợn
Áp dụng quy trình TCVN 5156 - 1990; lấy mẫu và chuẩn bị mẫu theo TCVN 4833 - 1ọ 2: 2002; ựịnh danh vi khuẩn bằng máy Vitek..
- Chuẩn bị mẫu:
Lấy 225 gram thịt ( loại bỏ mỡ, lấy cả chất lỏng) ựồng nhất mẫu với tỷ lệ 1 phần mẫu và 9 phần môi trường BHI bằng mý Stomacher, thời gian 1 phút. Huyễn dịch thu ựược có ựộ pha lỗng là 10-1. Tiếp tục pha loãng mẫu với các ựậm ựộ 10-2, 10-3,...tuỳ theo dự kiến sự ô nhiễm vi khuẩn trong thịt tiến hành nuôi cấy: một mẫu xét nghiệm phải cấy ắt nhật 3 ựậm ựộ liên tiếp nhau, mỗi ựậm ựộ cấy vào 2 ựĩa thạch Bair Ờ parker. Mỗi ựậm ựộ cần kiểm tra, lấy 1 ml dịch pha loãng cho vào giữa ựĩa thạch, ựổ 12 Ờ 15 ml thạch 450C vào giữa ựĩa petri, xoay và nghiêng ựều về các phắa ựể ựĩa thạch ựông tự nhiên, lật úp ựĩa thạch, ựặt vào tủ ấm 370C ổ 10C trong 24 - 48h. đếm số khuẩn lạc: căn cứ vào ựặc ựiểm Staphylococcus aureus phát triển tốt trong môi trường Baird - Parker tạo khuẩn lạc màu ựen, lồi, trịn, bờ ựều, bóng và có vịng trong suốt ở xung quanh do sự dung giải protein của lòng ựỏ trứng. Giám ựịnh
Staphylococcus aureus bằng cách thực hiện các phép thử kiểm tra ựặc tắnh làm ựông
huyết tương của vi khuẩn.
Thử phản ứng ựơng vón trên phiến kắnh: nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên phiến kắnh, dùng que cấy lấy vi khuân vừa ựủ trộn thành huyễn dịch ựục ựều, nhỏ tiếp một giọt huyết tương vào (thắ nghiệm ựối chứng một giọt nước muối sinh lý, một giọt huyế tương), sau ựó quan sát khả năng ựơng huyết tương trên phiến kắnh bằng kắnh lúp hoặc kắnh hiển vi.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 48
Trường hợp thử ựơng vón trên phiến kắnh là âm tắnh, có thể làm tiếp phản ứng