III. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của DNA
1.5. Sequencing gel (gel giải trình)
1.5.1. Điều chế dung dịch acrylamide (để chế gel polyacrylamide)
1) Trộn các hóa chất theo bảng dưới đây để có dung dịch acrylamide phù hợp với nồng độ gel cần chọn.
Nồng độ gel (%) 5 6 8 12 20
Urea (g) 50 50 50 50 50
TBE 20× (ml) 5 5 5 5 5
Dịch polyacrylamide 40% (ml)* 12,5 15 20 30 50
Nước, pha cho đủ (qs) (ml) qs 100 qs 100 qs 100 qs 100 qs 100 *Dịch polyacrylamide 40% được chế bằng cách trộn 190 g acrylamide với 10 g
N,N'-methylene-bis-acrylamide (bis-acrylamide) trong 500 ml nước, bọc chắn ánh sáng và bảo quản ở 4 ºC. Chú ý acrylamide là chất độc thần kinh, cần dùng bao tay và tránh hít phải bụi.
2) Ngay trước khi chế tác gel pha thêm 1/10 APS (ammonium persulfate) 10% và 20 TEMED.
1.5.2. Chế tác gel
1) Rửa sạch các tấm thủy tinh bản gel, sau đó lau bằng ethanol và để khô. 2) Sau khi bản thủy tinh khô xử lý mặt trong của tấm có tai (do cắt bớt) bằng silicone để khi bóc thủy tinh dễ dàng tách rời khỏi gel và không làm gel bị hư. Tuy nhiên, có thể không nhất thiết phải bôi silicone. Kẹp thanh ngăn (spacer) vào giữa các bản thủy tinh, chắn ba cạnh bảo đảm gel lỏng không chảy lọt, kẹp chặt bằng kẹp rồi đặt nằm ngang.
3) Sau khi thêm 10% APS và TEMED và trộn đều dịch acrylamide, dùng syringe hoặc pipet (cỡ lớn để hút một lần hoặc chỉ ít lần) lấy dịch acrylamide cho vào khe hở giữa hai tấm thủy tinh khuôn gel sao cho giữa hai tấm không có bọt khí. Sau khi đầy dịch gel ráp lược sâu khoảng 7 mm. Nếu lược răng nhọn thì ráp lưng của lược (như một tấm cách - spacer) chú ý đừng quá sâu vượt quá đường vạch đánh dấu trên tấm kính không tai.
Sau khi gel cứng hay trước khi điện di thì rút (lưng) lược ra và cắm phía răng lược nhọn thay vào vị trí đó (chú ý, ráp răng lược không quá sâu để tránh làm biến dạng gel (mặt đáy lỗ gel cầu vồng) nhưng không quá nông để đủ làm ngăn cách các khoảng răng lược. Khe hở giữa hai răng lược liền kề là nơi tải mẫu cần điện di.
1.5.3. Điện di
1) Ráp thiết bị điện di theo hướng dẫn của nhà cung cấp. Có loại cần rút (một cách cẩn thận) lược khỏi gel, có loại rút lưng lược khỏi gel rồi cắm phía răng lược vào vị trí đã rút đó để tạo những khoảng hở giữa các răng làm khe tải mẫu. Kiểm tra độ kín giữa bản gel với thiết bị điện di, đổ đầy TBE vào chậu điện di. Dùng syringe lớn kèm kim tiêm (uốn cong) hút TBE này rồi phun vào dưới đáy bản gel để loại trừ bọt khí mắc kẹt ở đáy gel. Tải dịch màu trộn formamide vào gel và điện di tiền khởi (điện di chuẩn bị).
2) Trước khi tải mẫu dùng pipet hút hết urea tan từ gel khỏi khe tải mẫu (slot), nếu dùng lược răng nhọn thì sau khi rửa urea cắm răng lược vào đầu trên của gel. Mẫu được tải vào đáy lỗ bằng pipet có đầu nhỏ (Gilson...) hoặc ống thủy tinh đầu nhỏ tạo thành lớp mỏng ở đáy lỗ.
3) Điện di phát nhiệt nhưng cần tiến hành dưới điện áp cao trong chừng mực các tấm thủy tinh không bị vỡ. Dưới 1.500 - 3.000 V cần điều chỉnh để cường độ dòng điện trong phạm vi không quá lớn. Lấy mức di động của dịch màu làm tiêu chuẩn để dừng điện di. Tốc độ di động phụ thuộc vào nồng độ của gel nhưng với gel polyacrylamide 6% thì BPB tương ứng với khoảng 23 nucleotide còn XC với 110 nucleotide. (Với các máy giải trình tự động thì việc theo dõi băng màu này là không cần thiết nhờ khả năng đọc và lưu thông tin thực thời).
1.5.4. Tự ký phóng xạ (autoradiography)
Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel khỏi thiết bị, lấy tấm thủy tinh có tai khỏi gel (nhờ silicone mà việc lấy ra khá dễ dàng), thực hiện tự ký phóng xạ bằng một trong những phương pháp sau đây.
1) Cho gel lên bề mặt một tấm film X-quang đã sử dụng (film cũ), đậy gel bằng một tấm Saran wrap, đưa vào buồng tối và đặt lên đó một tấm film X-quang mới để thực hiện tự ký phóng xạ ở −70 ºC.
2) Để nguyên bản gel trên tấm thủy tinh, thấm gel bằng acetic acid 10% rồi methanol 10%, để yên 15 - 20 phút, chuyển gel sang giấy thấm 3MM, làm khô trong máy sấy gel, sau đó tiến hành tự ký phóng xạ (trong buồng tối, ép sát gel lên tấm film X-quang, để 0,5 đến 1 giờ rồi rửa film hiện ảnh).
Chú ý: Phản ứng trên đây nhằm trình bày lại bước sơ khai của phản ứng giải trình nucleotide đã từng được thực hiện trước đây. Ngày nay với phát kiến ra enzyme DNA-polymerase chịu nhiệt có nguồn gốc từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq polymerase, rTaq
polymerase), ddNTP nhuộm phi phóng xạ (non-RI-dyed ddNTPs như ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit của Perkin Elmer Co.), máy luân nhiệt tự động hóa (thermocycler, programmed incubator) và thiết bị quang học nhận biết bức xạ huỳnh quang đọc bản gel trong suốt quá trình điện di (như Model 307A DNA Sequencer của Applied Biosystems kết nối computer hệ Macintosh, hoặc DSQ-1000L Automated Fluorescent DNA Sequencer của Shimazu Co. kết nối computer hệ Windows...), tính phiền tạp của việc giải trình DNA giảm đi nhiều và với hiệu suất cao hơn hẳn.
Nguyên lý của phương pháp như sau. Nếu bốn loại ddNTP được đánh dấu bằng bốn loại chất phát huỳnh quang khác biệt thì ta với một ống phản ứng ta có thể thu được các sản phẩm khác nhau và nếu điện di và nhận diện được bức xạ huỳnh quang khác biệt ta có thể xác định được trình tự phản ứng.