Nhờ những nghiên cứu protein kết hợp đặc hiệu DNA người ta biết được sự tồn tại của các nhân tố kết hợp các miền điều tiết phiên mã như miền operator, enhancer... South-Western hybridazation được thực hiện bằng cách điện di trong SDS-polyacrylamide gel các protein có trong dịch chiết xuất tế bào sau đó chuyển lên màng lọc (nitrocellulose, nylon) rồi dùng DNA đã đánh dấu nhận biết các protein kết hợp đặc hiệu. Có thể suy định được phân tử lượng của protein cũng như lợi dụng để kiểm định khi tinh chế protein. Nhìn chung, phương pháp này rất khó ứng dụng trong thực tế nhưng nếu được thì protein kiểm xuất được có tính đặc hiệu rất cao.
1. Điều chế dịch chiết xuất tế bào
Có thể sử dụng dịch chiết xuất toàn tế bào cũng như dịch chiết xuất nhân (tiết trước) với nồng độ KCl (hoặc NaCl) thấp hơn 0,2M. Nhưng cũng có thể điều chế dịch chiết xuất tế bào theo phương pháp dưới đây (thực hiện trong điều kiện nhiệt độ 0 - 4 °C).
1) Rửa tế bào nuôi thu được bằng dung dịch PBS, quay li tâm 5 phút ở 1.200 - 2.000 v/ph, thu cặn (tế bào).
2) Huyền dịch hóa tế bào trong dung dịch dung xuất sao cho nồng độ tế bào vào khoảng 35×106 tế bào/ml, hút nhả bằng pipet nhiều lần để huyền dịch hóa. Để trong nước đá 10 phút.
Dung dịch dung xuất chứa HEPES (pH 8,0) 10mM, NaCl
50mM, saccharose 0,5M, EDTA 0,1mM, DTT 1mM, Triton X-100 0,5% và MgCl2 5mM.
3) Chuyển sang ống Eppendorf, quay li tâm 3.000 v/ph trong 5 phút.
4) Thu cặn (nhân tế bào), huyền dịch hóa cặn bằng dịch dung xuất với lượng để có khoảng 70×106 tế bào/ml. Thêm 5 mM spermidine, 0,5 mM NaCl, trộn đều rồi để yên ống trong nước đá 30 - 60 phút. Li tâm 10 phút ở 12.000 v/ph.
5) Thu lấy nước mặt, thẩm tích đối dung dịch đệm thẩm tích trong 1 đêm.
Dung dịch đệm thẩm tích chứa 10 mM HEPES (pH 8,0),
50 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT và 50% (v/v) glycerol. 6) Chia ra từng lượng nhỏ vừa sử dụng. Đông kết trong nitơ lỏng rồi bảo
quản ở −80 °C.
2. Phương pháp South-Western blot (thẩm South-Western)
1) Thêm vào dịch chiết xuất (10 µg/làn) một lượng tương đương dung dịch mẫu nghiệm. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút sau đó điện di SDS-PAGE trong 7 - 15% acrylamide (thường 100 - 150 V, chú ý duy trì nhiệt độ 4 ºC nhờ bơm đối lưu).
Dung dịch mẫu nghiệm chứa Sarcosyl 5%, Tris-HCl (pH
6,6) 5mM, DTT 200mM, pyronin Y 0,05% và glycerol 20% (v/v). (Sarcosyl (tức sodium N-lauryl sarcosynate) là chất tẩy rửa không kết tủa khi nhiệt độ thấp cũng như khi trong dung dịch có ethanol). 2) Ngâm gel hai lần trong dung dịch chuyển thẩm mỗi lần 5 phút để cân bằng. Chuyển thẩm protein sang màng nitrocellulose (hoặc nylon) nhờ thiết bị chuyển thẩm dùng dòng điện một chiều. Sử dụng điện thế 60 V trong 5 - 6 giờ hoặc 30 V trong 1 đêm.
3) Lau nhẹ để loại bỏ dung dịch chuyển thẩm còn sót lại trên màng, ngâm màng trong dịch chứa sữa không kem 5% và HEPES (pH 8,0) 10mM trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
4) Rửa màng lọc bằng dịch kết hợp. Sau đó ủ màng trong dịch kết hợp có pha DNA đặc hiệu (dài khoảng 100 - 500 bp) đã đánh dấu [32P] có cường độ phóng xạ khoảng 1 - 5×105 cpm/ml. Điều kiện ủ là 1 giờ ở 30 ºC, trong túi lai có chứa 1 - 2 ml dung dịch lai/100 cm2 màng.
Dịch kết hợp chứa HEPES (pH 8,0) 10mM, NaCl 50mM,
MgCl2 10mM, EDTA 0,1mM, DTT 1mM và sữa bột không kem 0,25 %.
5) Sau đó rửa màng vài ba lần trong dịch kết hợp có pha thêm 0,2 M KCl, khoảng 1 giờ rửa tất cả, tự ký phóng xạ.