VI. Chế thư viện DNA bổ sung (cDNA library)
2.Phân đoạn nhờ li tâm chênh lệch nồng độ saccharose
1) Lấy ống li tâm siêu tốc, Hitachi 13 PA chẳng hạn, ngâm trong dung dịch diethyl pyrocarbonate 1% ở 37 °C qua đêm, hấp cao áp tiệt trùng, để khô. Cho vào đó dung dịch đường chênh lệch mật độ từ 5, 10, 15 và 20% (hoặc 5 ~ 30%).
Dung dịch đường chênh lệch mật độ chứa saccharose 5%
(và 10, 15, 20 và 30%, theo khối lượng/thể tích), Tris-HCl (pH 7,5) 10mM, EDTA 1mM và SDS 0,1%, hấp cao áp tiệt trùng.
2) Lắp ống chứa dịch đường chênh lệch mật độ vào rotor rồi lắp vào máy hạ nhiệt độ xuống mức nhiệt làm việc của máy là 15 °C trong 2 giờ cho cân bằng nhiệt độ toàn hệ thống li tâm.
3) Hòa tan kết tủa do ethanol của khoảng 100 µg poly(A)+RNA trong 100 - 200 µl nước cất đã tiệt trùng, thêm vào 1/20 lượng SDS 20%.
4) Đun nóng 70 °C trong 15 phút sau đó hạ nhanh nhiệt độ.
5) Tải mẫu lên đường chênh lệch mật độ. Để có dấu độ lớn phân tử lượng (size marker) đồng thời thực hiện với các RNA có độ lớn đã biết trước (ribosome 28S, 18S) trong ống khác cũng chứa dung dịch đường chênh lệch mật độ cùng loại và cũng được li tâm đồng thời.
đường với vận tốc 40.000 v/ph trong 15 giờ ở 15 °C thì RNA 18S sa lắng gần tận đáy ống. Li tâm trong 5 ~ 30% đường với vận tốc 22.000 v/ph trong 16 giờ ở 15 °C thì RNA 28S sa lắng ở tận giữa ống.
7) Chuyển từng phân đoạn, mỗi phân đoạn 0,4 ml, sang ống Eppendorf (được khoảng 30 phân đoạn).
8) Thêm vào mỗi phân đoạn 40 µl sodium acetate (pH 5,1) 3M và một lượng ethanol bằng hai lần dung lượng mẫu (mỗi phân đoạn), để ở −20 °C trong 1 giờ cho kết tủa, quay li tâm 15.000 v/ph trong 10 phút. Đổ bỏ nước mặt, thu cặn.
9) Tráng 3 lần bằng ethanol 70%. Hòa tan trong nước vô trùng theo nồng độ thích hợp. Bảo quản ở −20 ºC, nếu cần để lâu.
10) Thực hiện Northern blot hybridization (lai thấm Northern), điều tra hoạt tính của quá trình phiên mã (cho sản phẩm mRNA), chọn phân đoạn có nồng độ cao làm mRNA đích để tổng hợp cDNA.