X. Phân tích protein
2. Điện di SDS-polyacrylamide
Điện di mẫu trong gel SDS-polyacrylamide có thể phân tách được các protein theo độ lớn phân tử lượng nhờ làm biến tính bởi SDS. Trong môi trường có SDS các protein khác nhau đều đồng nhất về điện tích bề mặt nên chúng đều dịch chuyển trong điện trường về phía anode nhưng với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào độ lớn của phân tử (phân tử lượng). Gel SDS-polyacrylamide cấu tạo từ hai phần: gel tập trung và gel phân tách. Sau khi gel phân tách đã hóa rắn thì thực hiện đổ gel tập trung. Nồng độ của gel phân tách phụ thuộc vào độ lớn của protein cần phân tách. Nồng độ acrylamide càng cao thì phân tách được các phân tử protein càng nhỏ. Gel 5% acrylamide phân tách được protein có phân tử lượng 60 - 200 kDa, 10% thì 16 đến 70 kDa, 15% thì 12 đến 45 kDa. Ngoài ra, gel có nồng độ cao hơn có thể phân tách các protein nhỏ với chất lượng cao hơn.
2.1. Chế tác gel SDS-polyacrylamide
1) Lắp khuôn gel (có thể dùng loại như đối với phân li DNA). Thường sử dụng bản gel có độ dày 1 mm, rộng và dài 15 cm. Loại bản gel này cần khoảng 20 ml dịch nguyên liệu. Có thể dựa theo bảng dưới đây để chế tác gel phân tách (seperating gel) có nồng độ theo yêu cầu.
Thành phần (ml) Nồng độ của gel
5% 8% 10% 12% 15%
Tris-HCl 1,5M (pH 8,8) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Dung dịch acrylamide 30% 3,3 5,3 6,7 8,0 10,0
SDS 10% 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Ammonium persulfate (AP) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Nước 11,3 9,3 7,9 6,6 4,6
2) Thêm 10 µl TEMED, rót dịch vào khuôn gel đến 8/10 độ cao. Sau đó cho thêm nước cất hoặc ethanol một cách nhẹ nhàng lên lớp dung dịch acrylamide. Chờ gel cứng.
Dung dịch acrylamide 30% gồm acrylamide 29% và bis- acrylamide 1%.
3) Chế tác gel tập trung (stacking gel): Hòa 2,5 ml Tris-HCl 0,5M (pH 6,5), 1,5 ml dung dịch acrylamide 30%, 0,1 ml SDS 10%, 0,1 ml AP 10% và 5,8 ml nước cất.
4) Loại bỏ lớp nước hoặc ethanol trên lớp gel phân tách đã cứng. Thêm vào dung dịch gel tập trung 10 µl TEMED rồi rót trên gel phân tách đã cứng (thay thế nước hoặc ethanol). Ráp lược trên gel và chờ đến khi gel cứng (khoảng 1 - 2 giờ).
2.2. Điều chế mẫu, điện di và nhuộm
Lượng mẫu cần phân tích nếu nhuộm bằng Coomassie brilliant blue thì cần 0,5 - 1,0 µg/băng, còn nếu nhuộm bạc thì độ nhạy cao gấp khoảng 100 lần. Lượng tối đa có thế phân tích đương nhiên phụ thuộc vào số lượng băng nhưng có thể phân li được hàng trăm µg mỗi làn (với độ cao lỗ mẫu khoảng 1 cm và gel dày 1 mm).
1) Trộn khoảng 10 µl mẫu có nồng độ thích hợp với 10 µl dung dịch đệm 2×, xử lý ở 100 ºC trong 3 phút. Size marker protein (protein dấu phân tử lượng) cũng được xử lý tương tự và điện di bên cạnh.
Dung dịch đệm 2× chứa Tris-HCl (pH 6,5) 50mM,
glycerol 10%, SDS 2%, BPB 0,1% và 2-mercaptoethanol 2% (thêm mercaptoethanol ngay trước khi sử dụng).
2) Sau khi gel đã cứng, rút lược khỏi bản gel, loại bỏ hết khí nếu có trong gel, ráp vào thiết bị điện di, đổ đầy chậu trên và dưới của thiết bị điện di. Tải 5 - 20 µl mẫu vào lỗ tải mẫu, điện di 100 - 105 V cho đến khi BPB tiến sát đến mép dưới của bản gel thì dừng (khoảng 2 - 3 giờ).
3) Nhuộm bằng CBB: Lấy gel ra khỏi thiết bị điện di, ngâm vào dung dịch thuốc nhuộm CBB, đảo lắc nhẹ nhàng khoảng 2 giờ đến qua đêm.
Dung dịch thuốc nhuộm CBB chứa Coomassie brilliant
blue (CBB) R-250 0,1%, methanol 50% và acetic acid 10%.
4) Ngâm gel vào dịch tẩy màu (chứa 10% methanol, 7% acetic acid). Cho vào đó ít tấm giấy thấm Kimwipe để hấp thụ chất màu, đảo lắc nhẹ nhàng để tẩy màu.
5) Có thể chụp ảnh tồn trữ tư liệu hoặc là đặt lên giấy thấm 3MM rồi làm khô bằng máy sấy gel. Tương tự, cũng có thể bảo quản tốt hơn nếu kẹp gel ướt vào giữa hai tấm màng celophan sao cho không còn không khí giữa hai tấm màng rồi đưa vào sấy khô trong máy sấy (80 ºC trong khoảng 2 giờ).