X. Phân tích protein
1. Định lượng protein (phương pháp Bradford)
Để xác định nồng độ protein có phương pháp Lowry là phương pháp cổ điển, chính xác, có độ tin cậy cao được sử dụng bên cạnh phương pháp chuẩn Kjehldal. Tuy nhiên, cũng còn có phương pháp giản tiện hơn và có thể giúp xác định khá nhanh chóng nồng độ protein được ưa dùng gần đây là phương pháp Bradford được giới thiệu dưới đây.
1.1. Điều chế các hóa chất
1) Hòa tan hoàn toàn 100 mg thuốc nhuộm Coomassie brilliant blue G-250 (CBB-G250, Merck, Sigma, Eastmann Kodak...) vào 50 ml ethanol 95%. 2) Thêm vào 100 ml phosphoric acid 85%, trộn đều rồi cho thêm nước cho đủ 1 lít, cho vào lọ có bọc chắn sáng để bảo quản.
1.2. Định lượng
1) Cho 100 µl dung dịch protein vào 5 ml dung dịch Bradford, trộn đều. Đồng thời pha tương tự đối với 100 µl dịch đối chứng không chứa protein. Trong vòng 2 phút cho đến 1 giờ đo độ hấp thụ ánh sáng bức xạ ở bước sóng 595 nm. Dùng dung dịch protein (như albumin...) có nồng độ đã biết pha dãy có nồng độ loãng dần, làm tương tự để thiết lập đường cong chuẩn, trong khoảng 100 µg/ml đến 1 mg/ml ta có đồ thị tuyến tính. Do glycerol, 2-mercaptoethanol, SDS, ammonium sulfate, Tris... cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả đo, vì vậy nên sử dụng các dung dịch này (không chứa protein) để làm đối chứng.
2) Nếu muốn tăng độ nhạy của phương pháp thì làm tương tự với nồng độ protein thấp hơn thì thêm 100 µl vào 1 ml dung dịch Bradford rồi thực hiện trắc định tương tự cũng ở bước sóng 595 nm. Khi đó có thể đo protein với nồng độ từ 20 µg đến 200 µg.