X. Phân tích điều tiết phiên mã nhờ thử nghiệm CAT (CAT assay)
1. Chuyển Southern (Southern transfer)
1) Phân giải DNA mẫu bằng enzyme hạn chế, điện di để phân li trong gel agarose. Khi đó nên điện di đồng thời trong 1 làn gel DNA MW marker đã đánh dấu phóng xạ như [32P]Hind III marker DNA, chẳng hạn.
Chú ý: cũng có cách khác là dùng DNA MW marker không đánh dấu phóng xạ nhưng sau khi điện di (trong gel chứa ethidium bromide) thì đặt dọc theo gel một thước milimetre phát huỳnh quang dưới UV và chụp ảnh (bằng pollaroid film) (hoặc đo đoạn đường dịch chuyển của các băng đích nếu bản gel điện di với số lượng làn hạn chế) để đánh dấu kích thước phân tử theo độ dài dịch chuyển các băng.
2) Ngâm gel vào 150 ml dung dịch NaOH 0,2N - NaCl 0,6M, trộn lắc nhẹ trong 30 phút đến 1 giờ để làm biến tính DNA. Chú ý không ngâm gel agarose quá lâu trong dung dịch kiềm vì gel sẽ bị mềm và dễ vỡ và dính vào màng khi chuyển nucleic acid và làm cho màu nền (background) quá đậm.
3) Rửa gel bằng nước loại ion rồi ngâm trong 150 ml Tris-HCl (pH 7,5) 0,6M trộn đảo nhẹ trong 1 giờ, giữa chừng thay dịch. Bằng cách này trung hòa gel.
4) Cắt một tấm màng nitrocellulose hoặc nylon kích thước bằng kích thước tấm gel, ngâm vào nước cất cho thấm ướt đều rồi ngâm vào dung dịch SSC 10×.
Dung dịch SSC 10× chứa 3 M NaCl và 0,3 M sodium
citrate (pH 7,0).
5) Chuyển thấm DNA: việc chuyển được thực hiện nhờ dòng dung dịch đệm ngấm dần từ dưới lên (từ chậu chứa) nhờ tính mao dẫn (qua tấm giấy lọc lót) từ một tấm giấy lọc lớn vắt qua tấm thủy tinh làm cầu để dung dịch SSC 10× lưu dẫn từ trong chậu chứa qua một tấm giấy lọc 3MM đến gel rồi màng nitrocellulose rồi đến các lớp khăn giấy (có tác dụng hút dịch) đặt trên (hình 7).
Chú ý: có thể thay thế cầu thủy tinh và tờ giấy thấm nêu trên bằng một tấm mút nhưng coi chừng các chất bảo quản trong mút có thể làm trở ngại blotting và tạo màu nền đậm). Lớp khăn giấy (phía trên gel và màng) được ép bởi một tấm thủy tinh phẳng và một khối đủ nặng (khoảng 200 - 300 g, để các lớp dính sát vào nhau). Thời gian để chuyển bằng phương pháp mao dẫn khoảng 10 giờ (để qua đêm). Cần lưu ý bọc kín cả hệ thống bằng màng polyethylene (Saran wrap) để giấy không bị khô trong suốt quá trình chuyển thấm. Hơn nữa, ngày nay người ta áp dụng thay thế phương pháp chuyển thấm DNA nêu trên bằng dòng điện một chiều (electroblotting) qua hai bản cực có diện tích lớn (semi-dry transfer equipment). Cần tuân thủ quy trình của nhà sản xuất. Do chuyển nhanh (10 phút đủ để chuyển các đoạn DNA lớn hơn 10 kb), chất lượng chuyển cao như DNA ít bị xê lệch và DNA không bị giảm lượng do bị phân giải nên semi-dry transfer system được ưa dùng. Ban đầu chuyển ở điện áp 10 V trong 1 giờ ở 5 ºC, các DNA ngắn chuyển tốt hơn ở điện áp thấp, sau đó tăng điện áp đến 40 V trong 2 giờ ở 5 ºC để kết thúc chuyển.
6) Khi kết thúc chuyển, đánh dấu vị trí điểm xuất phát điện di và chiều điện di (cắt một góc của màng bằng kéo, chẳng hạn). Ngâm trong SSC 2×, rửa nhẹ.
7) Kẹp màng giữa hai tấm giấy lọc, xử lý làm khô ở 80 ºC trong 2 giờ.
Chú ý: có thể sử dụng UV để cố định DNA trên màng lọc. Khi đó dùng đèn có bước sóng 254 nm, đặt màng ướt ở trên một miếng giấy thấm 3MM ướt (tránh màng bị khô) và dưới đèn khoảng 25 cm trong 1 - 2 phút.
2. Lai (hybridization)
1) Ngâm màng đã khô trong dung dịch SSC 3×, ủ trong 30 phút ở 60 ºC. 2) Thực hiện lai tiền khởi (prehybridization) trong 2 giờ với dung dịch prehybridization ở 65 ºC.
Dung dịch prehybridization chứa 25 ml SSC 20×, 10 ml
SDS 10%, 10 ml dung dịchDenhardt 10×, thêm nước (55 ml) cho đủ 100 ml.
3) Cho màng vào một túi polyethylene, chú ý không gập màng, (tốt nhất là kẹp màng vào giữa hai nửa của một tấm polyethylene đã gập đôi, sau đó hàn ba mép còn lại của hai lớp, cắt một góc để bơm dịch lai), thêm vào túi lượng vừa đủ dung dịch hybridization (~10 ml), hàn miệng túi, chú ý tránh để tồn lưu bọt khí trong túi. Ủ ở 65 ºC trong 1 đêm.
Dung dịch hybridization chứa 1,5 ml NaCl 5M, 0,1 ml
Tris-HCl 2M (pH 8,0), 0,05 ml EDTA 0,5M, 1 ml dung dịch Denhardt 10×, 1ml SDS 10%, 0,5 ml DNA cá hồi đã biến tính 1 mg/ml và mẫu dò đánh dấu bằng 32P đã biến tính 1 - 3×107 cpm, tổng 10 ml.
Dung dịch Denhardt 10× chứa 2% BSA fraction V, 2%
polyvinyl pyrrolidone và 2% ficoll 400 (Pharmacia); sử dụng BSA thường gặp nấm mốc nên khi dùng mới pha, bảo quản ở tủ lạnh chỉ được 1 tháng.
Chú ý: Một số màng lọc như Gene Screen Plus... cần phải lai tiền khởi (prehybridization) 8 giờ.
Có thể tái sử dụng màng lọc nylon (như Nitran của S&S...), khi đó ngâm màng trong NaOH 0,2N ở nhiệt phòng trong 2 giờ loại bỏ mẫu dò không có tương tác bổ sung, rửa nước cho sạch rồi trung hòa bằng dung dịch chứa 0,2 M Tris-HCl (pH 7,2) và 0,1% SDS. Ngâm trong túi polyethylene chứa dung dịch prehybridization trong 2 giờ ở 65 phút rồi bảo quản ở tủ lạnh, bảo quản được lâu trong buồng lạnh sâu. Khi dùng lấy ra cho ấm ở 65 ºC rồi thực hiện từ bước lai (hybridization).