VI. Chế thư viện DNA bổ sung (cDNA library)
1.Điều chế RNA-polyA nhờ cột cellulose gắn d(T)
1.1. Chế tác cột gel
1) Lấy một ống hút Pasteur nhét một ít bông thủy tinh vào trong chỗ thắt rồi nung tiệt trùng hoặc nhét bông tẩy dầu mỡ rồi hấp cao áp tiệt trùng.
Chú ý đừng nhét bông quá chặt để dòng chảy qua không bị trở ngại nhưng cũng đừng quá lỏng có thể làm chảy gel.
2) Cân 0,5 g bột Oligo(dT) cellulose (Pharmacia type 7, chẳng hạn), ngâm vào nước cất cho trương đều (0,5 g thành 1,5 ml).
3) Tải vào cột 1,5 ml gel. Để tránh dòng chảy quá chậm có thể cho trước một ít Sephadex G-50 thì tốt hơn.
4) Rửa bằng mấy ml dung dịch NaOH 0,1N.
5) Rửa bằng dung dịch đệm dung xuất, kiểm tra pH dịch thoát ra bằng giấy đo pH cho đến khi dịch thoát ra có phản ứng trung tính.
Dung dịch đệm dung xuất chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM,
EDTA 1mM và SDS 0,1%, hấp cao áp tiệt trùng. 6) Cân bằng cột bằng mấy ml dung dịch đệm NaCl 0,5M.
Dung dịch đệm NaCl 0,5 M chứa 10 mM Tris-HCl (pH
7,5), 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA và 0,1% SDS, hấp cao áp tiệt trùng.
1.2. Sắc ký cột (column chromatography)
1) Hòa tan RNA đã kết tủa bằng ethanol trong dung dịch dung xuất (nêu trên) sao cho đạt đến nồng độ khoảng 1 mg/ml. Thêm lượng tương đương
dung dịch đệm NaCl 1M. Làm như vậy nồng độ muối NaCl sẽ là 0,5M.
Dung dịch đệm NaCl 1M chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM,
NaCl 1,0M, EDTA 1mM và SDS 0,1%, hấp cao áp tiệt trùng. 2) Để ở 65 °C trong 5 phút rồi hạ nhiệt nhanh trong nước đá. Quay li tâm (3.000 v/ph trong 5 phút) loại bỏ tạp chất không tan, thu nước mặt.
3) Tải dung dịch RNA vào cột. Khi đó 1 ml Oligo(dT) sẽ xử lý được khoảng 10 mg RNA. Chú ý khi nhiệt độ thấp SDS có thể tách khỏi dung dịch.
4) Tải dịch thoát qua lần đầu lên gel lần nữa.
5) Rửa cột bằng một số lần lượng dung dịch đệm NaCl 0,5M cho đến khi dịch thoát ra từ cột có OD260 hạ thấp.
6) Lại rửa cột bằng một số lần lượng dung dịch đệm NaCl 0,1M cho đến khi dịch thoát ra từ cột có OD260 hạ thấp.
7) Dung xuất bằng dung dịch dung xuất (nêu trên) thu từng phân đoạn khoảng 500 µl. Kiểm tra OD260 để thu thập các ống có độ hấp thụ đỉnh. Nếu không kiểm tra OD260 thì có thể thu từng lượng nhỏ 1 - 5 µl dịch dung xuất pha thêm 20 µl ethidium bromide (1 µg/ml) rồi nhỏ lên giấy chất dẻo
mỏng Saran wrap, chiếu tử ngoại từ phía dưới để kiểm tra RNA (nếu có, RNA sẽ phát huỳnh quang da cam).
8) Thêm 1/10 thể tích sodium acetate (pH 5,1) và hai lần lượng ethanol cho kết tủa ở −20 ºC.
9) Nếu cần tinh chế poly(A)+RNA thì lặp lại các bước từ bước tải Oligo(dT) cellulose.
1.3. Phục hồi cột
1) Rửa cột bằng mấy ml NaOH 0,1N.
2) Rửa bằng mấy ml dung dịch dung xuất cho đến khi dịch thoát ra có phản ứng trung tính.
3) Cân bằng cột bằng dung dịch đệm NaCl 0,5M.
4) Nếu cần bảo quản lâu thì sau khi tải cột, cho cột đầy nước cất pha sodium azide 0,02% hoặc dung dịch đệm dung xuất chứa sodium azide (NaN3), nút kín hai đầu bằng parafilm, cất ở 4 ºC.