VII. Tạo dòng thuần DNA bộ gen
1. Vector phage
Việc lựa chọn vector phage loại này hay loại khác phụ thuộc vào chủng loại enzyme hạn chế được sử dụng và độ dài DNA có thể được dòng hóa, còn các thao tác kỹ thuật thì hầu như giống nhau. Dưới đây giới thiệu một số vector phage đã từng sử dụng trong việc chế tác thư viện DNA genome.
Charon 4A: có thể clone các đoạn dài 7 - 20 kb vào vị trí của Eco
RI (G↓AATTC). Có thể chế tác thư viện bằng cách tiêu hóa Eco RI và cũng có thể chế tác thư viện từ các đoạn DNA genome cắt bởi các enzyme nhận biết 4 base (Alu I (AG↓CT), Hae III (GG↓CC)...) rồi gắn với linker cho Eco
RI. (Bằng các enzyme nhận biết nhiều base như các enzyme này trở lên thì các đoạn DNA được tạo ra không bị cắt quá ngắn và có khả năng chứa gen cấu trúc).
Charon 28 (và Charon 30): Có thể clone hóa đoạn DNA dài 6 - 19
kb vào vị trí của Bam HI. Có thể sử dụng để tạo dòng các đoạn cắt bởi
Bam HI (G↓GATCC,) Bgl II (A↓GATCT), Bcl I (T↓GATCA) nhưng thường sử dụng để dòng hóa các đoạn của Sau 3A hoặc của Mbo I (↓GATC).
EMBL 3 (và EMBL 4): Có thể sử dụng để clone hóa các đoạn dài
9 - 23 kb vào vị trí của Eco RI, Bam HI, Sal I. Do có polylinker ở vị trí dòng hóa nên có thể xử lý nhiều enzyme để có thể làm giảm DNA nền (tức không đủ ngắn để có thể được dòng hóa vào vị trí cắt của một enzyme hạn chế). Thí nghiệm trình bày dưới đây sử dụng hệ Charon 28-Sau 3A.
Các hệ vector-enzyme khác cũng có những thao tác tương tự. Đồng thời, cũng có những biến thể khác có thể vận dụng với kết quả tốt.
1.1. Điều chế vector
vị trí xác nhận và tác dụng của Bam HI nằm ngoài khu vực điều tiết tự sao của phage nên có thể loại bỏ bớt một đoạn ngắn nhờ enzyme này mà không làm mất năng lực dung khuẩn của phage.
2) Thêm 3 đơn vị Bam HI vào 1 µg DNA, cho phản ứng 2 giờ.
3) Lấy 0,5 µg (hoặc một phần nếu lượng ban đầu thay đổi) xử lý 10 phút ở 68 °C rồi làm lạnh nhanh trong nước đá để ngăn trở sự gắn kết trở lại của các đầu dính, sau đó thực hiện điện di trong gel agarose 0,5 % để kiểm tra sự phân cắt hoàn thành. Sau khi xác nhận sự phân cắt, xử lý phenol- chloroform và kết tủa bằng ethanol.
4) Hòa tan trong 500 µl dung dịch chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM và MgCl2 10mM.
5) Ủ 1 giờ ở 42 °C làm kết nối các đầu dính.
6) Dùng li tâm chênh lệch mật độ đường để loại bỏ những sản phẩm không cần thiết. Để làm điều đó cần chế dịch chênh lệch mật độ đường từ 10% đến 40% trong dung dịch đệm chứa các thành phần sau: NaCl 1M, Tris- HCl (pH 7,5) 20mM và EDTA 5mM. Cho các lớp dịch đường (theo thứ tự nồng độ giảm dần, dưới cùng 40%, trên cùng 10%) vào ống chuyên dụng cho rotor cao tốc (như RPS 25.1 của Hitachi...), tải 250 µl DNA lên mỗi ống chứa đường chênh lệch mật độ, quay li tâm với rotor doãng góc (swing-out rotor) ở 22.500 v/ph trong 24 giờ.
6) Phân đoạn từng 1 ml.
7) Từ mỗi phân đoạn lấy một lượng nhỏ mẫu để điện di kiểm tra: lấy 5 µl mẫu hòa vào 10 µl nước và 5 µl dung dịch màu tải mẫu 6× để 10 phút ở 68 °C trong 10 phút rồi điện di trong gel agarose 0,4%.
8) Thêm dung dịch TE vào phân đoạn có chứa DNA phage sao cho lượng TE bằng hai lần lượng mẫu, rồi gây kết tủa bằng ethanol.
1.2. Thí nghiệm cắt chuẩn bị từng phần bằng Sau 3A
Cắt từng phần DNA bằng Sau 3A quyết định chất lượng của thư viện bởi vì enzyme này tác động càng lâu và với lượng càng nhiều thì tạo được các đoạn DNA càng ngắn từ DNA có phân tử lượng lớn. Hơn nữa, năng lực phân cắt của enzyme này đối với DNA có phân tử lượng lớn là có sự hạn chế và phụ thuộc nhiều vào phương pháp điều chế DNA. Do đó, muốn có thư viện genome thích hợp cần thực hiện bước tiêu hóa chuẩn bị để chọn chế độ xử lý enzyme thích hợp.
thêm vào đó 0,1, 0,3, 1,0 3,0 và 10 đơn vị Sau 3A, ủ một giờ.
2) Làm lạnh ở trong nước đá, thêm EDTA cho đến 20 mM để dừng phản ứng. Điện di 3 µg DNA trong gel agarose 0,4%.
3) Chọn chế độ xử lý với lượng Sau 3A cho nhiều đoạn DNA có phân tử lượng 15 - 20 kb nhất.
1.3. Điều chế đoạn DNA để đưa vào tổ hợp
1) Cắt lượng 200 µg DNA có phân tử lượng lớn với nồng độ Sau 3A đã chọn, bên cạnh hai nồng độ Sau 3A lượng lớn hơn (1,5 lần) và nhỏ hơn (0,7 lần).
2) Làm lạnh ở 0 ºC, thêm cho đạt 20 mM EDTA để dừng phản ứng. 3) Lấy 3 µg để điện di trong gel agarose 4%.
4) Chọn sản phẩm chứa nhiều đoạn DNA có độ dài thích hợp, thực hiện li tâm phân đoạn trong các ống chênh lệch mật độ đường.
5) Chọn các phân đoạn có độ dài 15 - 20 kb (di động chậm hơn MW marker chút ít do nồng độ muối cao), thêm vào đó 2 lần TE (và carrier RNA, cho dễ kết tủa), kết tủa bằng ethanol.
6) Kiểm tra lại phân tử lượng của các đoạn DNA bằng cách điện di trong gel agarose bên cạnh DNA MW marker.
1.4. Ligation (kết nối)
1) Thông thường thiết lập phản ứng với các trường hợp kết nối DNA vector và DNA mẫu với một số tỷ lệ nồng độ khác nhau để tăng khả năng hình thành những tổ hợp kết nối thích hợp. Đồng thời, cũng nên thiết lập phản ứng kết nối khống với chỉ DNA mẫu (không có DNA vector).
Phản ứng chính có thể thực hiện trong ống Eppendorf với tổng lượng 10 µl chứa những thành phần sau: 2 µg DNA vector, 1 µg DNA mẫu, 1 µl dung dịch đệm kết nối (ligation buffer) 10×, 100 đơn vị T4 ligase, thêm nước cho đủ 10 µl. Các thí nghiệm kết nối "khống" có lượng bằng 1/2 thí nghiệm chính. (Dung dịch đệm kết nối 10× được bán kèm với enzyme T4 ligase).
2) Ủ 14 °C trong 1 đêm.
3) Lấy 2 µl dịch từ mỗi ống pha với 5 µl nước và 2 µl dung dịch màu tải mẫu 6× và điện di trong agarose, xác nhận sự kết nối (độ dài DNA vượt quá 50 kb).
1.5. in vitro packaging
1) Lấy SE (Sonic Extract) và FTL (Freeze Thaw Lysate) ra khỏi tủ lạnh sâu, cho tan chảy ở trong nước đá hay 0 °C. (Các dịch này thường đựng trong ống nhỏ với lượng đủ dùng).
2) Thêm 3 µl dịch phản ứng chính (nêu ở mục trên) vào lọ SE, trộn nhẹ cho đều rồi thêm 15 µl FTL, trộn nhẹ.
3) Làm tương tự với phản ứng kết nối chỉ vector (nêu ở mục trên). 4) Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1,5 đến 2 giờ.
5) Thêm 500 µl SM rồi thêm một số giọt chloroform, trộn đảo, giữ ở 4 °C. 6) Từ mỗi phản ứng (chính và chỉ vector) này lấy 1 - 5 µl trải lên mặt môi trường thạch, kiểm tra tỷ suất packaging. Tỷ suất phage vector lắp ráp cao trong thí nghiệm kết nối chỉ vector có nghĩa là trong nhiều phage ở thí nghiệm chính không có DNA đích kết nối vào (kết quả thư viện không mong muốn).
1.6. Sàng lọc
1) Cấy đĩa: Thêm khoảng 50×103 pfu phage đã lắp ráp vào 300 µl vi khuẩn chủ E. coli C600 đã cấy qua đêm trong môi trường có pha thêm 0,2% maltose (để cảm ứng tạo thụ thể bề mặt cho phage), ủ 10 phút ở 37 °C. 2) Thêm vào 50 ml agarose phủ mặt (top agar, 0,7% agarose-NZYM) để ấm ở 50 °C, rồi rót lên bề mặt thạch NZYM đường kính 150 mm.
3) Để top agar cứng thì ủ đĩa ở 37 °C trong 1 đêm.
4) Thực hiện plaque hybridization như đối với clone hóa cDNA.
1.7. Điều chế thư viện (phương pháp dung giải trên đĩa)
Sau khi có những sản phẩm, tức các đoạn DNA, tổ hợp vào phage vector ta có thể tuyển lựa và làm tăng lượng mỗi một dòng thuần để bảo quản, sản xuất protein đích, sequencing... Việc đó được gọi là điều chế thư viện. Dưới đây giới thiệu phương pháp dung giải trên đĩa được coi là có kết quả chắc chắn.
1) Thêm 9 ml SM vào đĩa Petri loại 150 mm đã hoàn thành việc sàng lọc, cho lan rộng kỹ, sau đó thêm mấy giọt chloroform.
2) Ủ 1 đêm ở 4 °C.
đó ít giọt chloroform, ủ ở 4 °C. Thu được lysate chứa khoảng 1 triệu pfu/µ l. Ở trạng thái này có thể để hàng tháng không giảm hiệu giá, nếu cho thêm 80% glycerol thì bảo quản ở −80 °C đến gần như vĩnh viễn.