V. Phương pháp định lượng nucleic acid (DNA và RNA)
2. Điều chế lượng lớn DNA plasmid
2.1. Nuôi cấy vi khuẩn
1) Lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc trắng bằng que cấy hoặc tăm đã tiệt trùng vào 5 ml môi trường LB có thêm chất kháng sinh thích hợp (penicillin,
chloramphenicol..., tùy thuộc vào loại plasmid vector có mang gen kháng thuốc đối với chất kháng sinh này hay chất kháng sinh khác).
2) Ủ 1 giờ ở 37 °C.
3) Chuyển lứa cấy vi khuẩn trên vào 400 ml môi trường LB, tiếp tục nuôi cấy ở 37 °C cho đến khi OD600 = ~ 0,8.
4) Thêm 2 ml chloramphenicol (dung dịch pha trong ethanol có nồng độ 34 mg/ml, bảo quản ở −20 °C), ủ tiếp khoảng 12 - 20 giờ. Bước gây cảm ứng này có thể không cần thiết đối với nhiều loại plasmid vector.
5) Quay li tâm 5.000 v/ph trong 10 phút để tập trung tế bào. Bỏ nước mặt. Thêm vào cặn 40 ml dung dịch STE ở 4 ºC, trộn đều tạo huyền dịch tế bào.
Dung dịch STE chứa NaCl 0,1M, Tris-HCl (pH 7,8) 10mM và EDTA 1mM.
6) Chuyển sang ống li tâm cỡ 50 ml, quay li tâm 5.000 v/ph trong 10 phút, loại bỏ nước mặt.
2.2. Chiết xuất DNA
1) Cho vào (ống đã chuẩn bị ở bước 6) mục trên) 7 ml dung dịch glucose- lysozyme, trộn đều tạo huyền dịch, để ở nhiệt độ phòng 10 phút.
2) Thêm 14 ml dung dịch kiềm (chứa NaOH 0,2N và SDS 1%), làm lạnh trên nước đá, vừa trộn đều nhẹ nhàng tránh làm đứt DNA, để lạnh 10 phút. 3) Thêm 10,5 ml potassium acetate, trộn đều, để 10 phút trong băng hay nước đá.
4) Quay li tâm 15.000 v/ph trong 20 phút ở 4 ºC, rồi chuyển dịch trong sang ống nghiệm 50 ml (Falcon, Corning...).
5) Thêm 0,6 lần isopropyl alcohol, trộn đều, để 10 phút ở nhiệt độ phòng. 6) Quay li tâm 3.000 v/ph trong 10 phút ở 4 ºC, loại bỏ hết phần nước mặt. 7) Rửa cặn bằng ethanol rồi để khô hoàn toàn (có thể dốc ngược ống trên giấy thấm, chú ý để hở miệng ống cho thoáng khí làm nhanh quá trình bay hơi của ethanol). Không cần làm khô trong chân không vì DNA quá khô sẽ khó hòa tan.
2.3. Điều chế plasmid bằng li tâm phân đoạn trong mật độ cesium chloride (CsCl) chloride (CsCl)
1) Cho 3,7 g CsCl (bột tinh thể) vào 3,5 ml dịch plasmid rồi thêm 0,2 ml ethidium bromide 10 mg/ml. Trộn đều cho CsCl tan hoàn toàn. Lượng này vừa đủ cho rotor máy li tâm siêu tốc.
2) Chuyển dịch nêu trên sang ống nhựa chuyên dụng cho máy li tâm siêu tốc, nếu các ống chưa đầy hoàn toàn thì làm đầy ống bằng CsCl hoặc parafin lỏng, kiểm tra khối lượng các ống để đảm bảo rotor có khối lượng cân đối.
3) Hàn ống hoặc gài miệng ống theo thiết kế.
4) Ráp ống vào rotor máy li tâm, chú ý sự cân bằng của rotor. Quay li tâm 55.000 v/ph ở 15 °C trong 15 giờ (dùng rotor RPV 65 T Hitachi, chẳng hạn).
5) Tắt máy li tâm. Nhẹ nhàng lấy rotor khỏi máy. Tháo các ống nhựa li tâm khỏi rotor, thông thường trong dịch hình thành hai băng tách biệt thấy được dưới UV (hình 6), băng dưới là DNA plasmid vòng khép kín (closed circular plasmid DNA). Phần dưới đáy tập trung các RNA. Dùng kim tiêm chọc thủng phần trên của ống hàn (hoặc mở nắp ống cài) cho thông khí (không thông khí thì sẽ không thể hút chiết phần dịch phía dưới qua kim tiêm). Giá ống li tâm đó vào kẹp đặt bên cạnh đèn tử ngoại để soi, rồi dùng kim tiêm chọc ngay phần dưới của băng DNA plasmid, hút băng plasmid vào syringe, chú ý tránh hút phần khác, đặc biệt là băng DNA khấc (nick) phân bố ở lớp trên. Cho vào ống nghiệm cỡ 30 ml (ống Corex...).
Hình 6: Phương pháp hút chiết băng DNA plasmid sau khi li tâm trong dịch chênh lệch mật độ cesium chloride.
Chú ý mang găng tay, mặt nạ chống UV trong khi thực hiện, cẩn thận không hút băng bao gồm các DNA đứt đoạn phía trên và RNA phía dưới.
UV
DNA đứt đoạn
6) Thêm vào một lượng tương đương butanol (hoặc propanol), trộn đều rồi li tâm 3.000 v/ph trong 1 phút butanol (propanol) cùng ethidium bromide sẽ nổi lên trên, hút bỏ lớp này rồi lặp lại 3 - 4 lần để loại bỏ hoàn toàn thuốc nhuộm (hết màu là được).
7) Thẩm tích đối TE để loại bỏ CsCl.
Nếu không thẩm tích có thể áp dụng các bước sau để loại trừ CsCl. Thêm hai lần TE, trộn đều rồi thêm 6 - 8 lần ethanol, quay li tâm 10.000 v/ph 20 phút ở 4 ºC, đổ bỏ nước mặt, thấm cho sạch nước, lại hòa tan trong 500 µl sodium acetate 3M rồi cho thêm ethanol bằng 2 lần thể tích dịch trong ống (1 ml), để 5 phút ở 0 ºC, quay li tâm như trên để thu tủa DNA plasmid.