III. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của DNA
2. Phương pháp Maxam-Gilbert
Phương pháp Maxam-Gilbert thực hiện đánh dấu hóa học từng phần đặc hiệu với bốn loại nucleotide (A, T, G và C). Sau đó, cắt phân tử DNA này một cách đặc hiệu tại vị trí đã đánh dấu. Cuối cùng, điện di sản phẩm phân giải DNA thu được trong gel polyacrylamide. Di động của các đoạn DNA trong điện trường phụ thuộc vào độ dài của chúng, nhờ đó xác định được trình tự nucleotide. Phương pháp này hầu như không còn được sử dụng mô tả ở đây với mục đích tham khảo.
1) Dùng polynucleotide kinase đánh dấu đầu 5' hoặc dùng enzyme Klenow đánh dấu đầu 3' của DNA bằng [32P], sau đó dùng enzyme hạn chế để cắt hoặc phân li bằng cách tách sợi (strand separation), điều chế các đoạn DNA đánh dấu một sợi.
2) Hòa tan [32P]DNA trong 20 µl nước cất, thêm 5 µl DNA (1 mg/ml) tinh dịch cá hồi.
3) Chia dịch DNA nêu trên ra 5 ống Eppendorf mỗi ống 5 µl.
4) Các mẫu được tiến hành đánh dấu hóa học của 5 loại base như nêu dưới đây.
2.1. Đánh dấu hóa học
2.1.1. G
1) Thêm 200 µl dung dịch đệm DMS, làm lạnh ở trong nước đá.
Dung dịch đệm DMS (DMS buffer solution) chứa 50 M
sodium cacodylate (pH 8,0) và 1 mM EDTA.
2) Thêm 1 µl DMS (dimethylsulfate), cho phản ứng 1 phút ở 20 ºC.
3) Thêm 50 µl dịch dừng DMS và 70 µl ethanol đã làm lạnh, trộn xoáy mạnh, để ở −70 ºC trong 15 phút.
Dịch dừng DMS (DMS stop solution) chứa sodium citrate
1,5M (pH 7,5), 2-mercaptoethanol 1,0M và tRNA 100 µg/ml. 4) Quay li tâm 10 phút, lấy tủa, hòa tan tủa trong 250 µl sodium citrate 0,3M.
5) Thêm 750 µl ethanol đã làm lạnh, trộn đều và để 15 phút ở −70 ºC. 6) Quay li tâm 10 phút, tráng tủa 2 lần trong ethanol 70%.
7) Làm khô bằng máy hút chân không.
2.1.2. A>C
1) Thêm 100 µl dung dịch NaOH 1,2N - EDTA 1mM, cho phản ứng trong 4 phút ở 90 ºC.
2) Thêm 150 µl acetic acid, 5 µl tRNA (1 mg/ml) và 750 µl ethanol 70% đã làm lạnh, trộn kỹ, để ở −70 ºC trong 15 phút.
3) Quay li tâm 10 phút, lấy tủa, hòa tan tủa trong 250 µl sodium citrate 0,3M.
4) Thêm 750 µl ethanol đã làm lạnh, trộn đều và để 15 phút ở −70 ºC. 5) Quay li tâm 10 phút, tráng tủa 2 lần trong ethanol 70%.
6) Làm khô bằng máy hút chân không.
2.1.3. G+A
piperidine, một dung môi hữu cơ có tính kiềm), phản ứng 1 giờ ở 20 ºC. 2) Làm đông khô.
3) Hòa tan DNA trong 20 µl nước cất. 4) Lại làm đông khô.
2.1.4. T+C
1) Thêm 20 µl nước cất, làm lạnh ở 0 ºC.
2) Thêm 25 µl hydrazine (HZ), phản ứng 6 phút ở 20 ºC.
3) Thêm 200 µl dung dịch dừng HZ (HZ stop solution) và 750 µl ethanol, để 15 phút ở −70 ºC.
Dung dịch dừng HZ chứa sodium acetate 0,3M, EDTA
0,1M và tRNA 25 µg/ml.
4) Quay li tâm 10 phút, lấy tủa, hòa tan tủa trong 250 µl sodium citrate 0,3M.
5) Thêm 750 µl ethanol đã làm lạnh, trộn đều và để 15 phút ở −70 ºC. 6) Quay li tâm 10 phút, tráng tủa 2 lần trong ethanol 70%.
7) Làm khô bằng máy hút chân không.
2.1.5. C
1) Thêm 5 µl nước cất và 15 µl NaCl 5M.
2) Thực hiện tiếp các thao tác như ở bước 2) đến 7) mục 2.1.4.
2.2. Phân giải bằng piperidine và điện di trong gel
1) Thêm 30 µl piperidine 1M vào mỗi ống DNA đã đánh dấu hóa học của cả 5 loại. Cho phản ứng ở 90 ºC trong 30 phút.
Chú ý rằng dung dịch piperidine cần chuẩn bị ngay trước khi sử dụng.
2) Đông khô.
3) Hòa tan DNA trong 20 µl nước cất, đông khô. 4) Lại hòa tan DNA trong 20 µl nước cất, đông khô. 5) Hòa tan DNA vào 10 µl dịch màu.
tốc. Điện di trong gel.