Phương pháp đánh dấu mẫu dò bằng digoxygenin

IV. Phương pháp đánh dấu DNA

5.Phương pháp đánh dấu mẫu dò bằng digoxygenin

5.1. Đánh dấu bằng digoxygenin nhờ phương pháp nhiều mồi

1) Đặt một ống Eppendorf 1,5 ml đã tiệt trùng lên trên nước đá (băng), cho lượng DNA cần làm khuôn (10 - 3000 ng DNA) và thêm nước cất cho đủ 10 µl.

2) Nhúng ống DNA khuôn nêu trên vào nước đang sôi trong 3 phút để biến tính DNA. Đưa nhanh vào nước đá. Quay li tâm khoảng 5 giây để tập trung các thành phần ngưng đọng trên thành ống (spin-down).

3) Đặt ống trở lại nước đá và thêm 2 µl hỗn hợp hexanucleotide (hexanucleotide mixture) 10× và thêm 2 µl hỗn hợp gắn digoxygenin (digoxygenin labeling mixture) 10×.

Hỗn hợp hexanucleotide 10× chứa 500 mM Tris-HCl pH

7,5, 100 mM MgCl2, 1 mM DTT, 2 mg/ml albumin huyết thanh bê (BSA).

Hỗn hợp gắn digoxygenin 10× chứa 1 mM mỗi loại dATP,

dCTP và dGTP, 0,65 mM dTTP, 0,35 mM digoxygenin-11-dUTP (Roche Molecular Biochemicals), điều chỉnh pH đến 7,5 và cất ở −20 ºC.

4) Thêm nước cất cho đủ 19 µl.

5) Trộn bằng cách xoáy trộn nhẹ rồi spin-down.

6) Thêm 1 µl enzyme Klenow (2 U/µl, trộn đều bằng cách hút nhả một số lần để bắt đầu phản ứng đánh dấu.

7) Ủ ở 37 C trong 2 giờ đến qua đêm.

8) Dừng phản ứng bằng cách thêm 1 µl EDTA 0,5 M pH 8,5. Bảo quản ở −20 ºC. Không cần làm sạch các thành phần phản ứng. Có thể cất mấy năm ở điều kiện này.

5.2. Đánh dấu bằng digoxygenin nhờ PCR

Các deoxynucleotide gắn digoxygenin, như digoxygenin 11-dUTP có thể được enzyme Taq polymerase sử dụng như một cơ chất phản ứng trong PCR (xem mục "PCR"). Phương pháp này vừa có tính đặc hiệu cao vừa sản xuất mẫu dò với hiệu suất lớn. Độ nhạy của các mẫu dò này trong nhiều ứng dụng khác nhau đều cao hơn các phương pháp đánh dấu khác. Tuy vậy, hiệu suất PCR giảm khi có mặt của cơ chất gắn digoxygenin, vì vậy cần đưa DIG-dUTP vào hỗn hợp phản ứng ở một tỷ lệ hợp lý so với lượng dTTP (thường 1:2 đến 1:6). Nếu phản ứng không cần mẫu dò với độ nhạy cao (như sàng lọc thư viện, lai khuẩn lạc và lai Southern) thì có thể giảm thấp lượng DIG-dUTP (đến 1:9).

Vật liệu cần thiết: Taq polymerase, DNA khuôn (tempelate DNA), cặp mồi (primers), dung dịch tồn trữ dATP, dCTP, dGTP và hỗn hợp dTTP với DIG-dUTP.

1) Đặt một ống 0,5 ml trong nước đá và cho lần lượt vào đó các thành phần được tính sẵn ứng với nhu cầu như trình bày ở bảng dưới đây.

Hóa chất Phản ứng 50 μl Phản ứng 100 μl Nồng độ cuối Dung dịch đệm PCR 10× 5 10 1× dNTP (-dTTP) 50× 1 μl 10 μl 200 μM mỗi loại Hỗn hợp DIG-dUTP + dTTP 5× 10 μl 20 μl 200 μM (toàn bộ) Primer xuôi 0,3-2,5 μl 0,5-5,0 μl 0,1-1,0 μM Primer ngược 0,3-2,5 μl 0,5-5,0 μl 0,1-1,0 μM DNA eukaryote (100 ng/μl) 1,0 μl 1,0 μl 100 ng DNA prokaryote (10 ng/μl) 1,0 μl 1,0 μl 10 ng

Taq polymerase (1 U/μl) 1 μl 2 μl 2 U/100 μl

Nước q.s. 50 μl q.s. 100 μl

Dùng pipet hút trộn một số lần. Chú ý không trộn đảo vì Taq polymerase nhạy cảm với sốc xoáy.

2) Thêm 25 μl dầu khoáng (mineral oil) vào mỗi ống. (Cắt bớt đầu côn màu vàng sẽ dễ lấy dầu hơn). Quay li tâm 5 phút. Với các máy luân nhiệt thế hệ mới thiết kế đốt nóng từ nắp máy thì không cần dầu khoáng vì không có hiện tượng ngưng tụ nước trên thành ống như các máy luân nhiệt đốt nóng từ đáy ống. Li tâm nhẹ để tập trung dịch phản ứng.

3) Thực hiện phản ứng PCR như thông thường trong khoảng 30 - 35 chu kỳ luân nhiệt. Chú ý sau chu kỳ cuối nên để nhiệt độ 72 ºC trong 5 phút cho phản ứng tổng hợp DNA diễn ra tốt hơn.

Không cần loại bỏ các thành phần chưa phản ứng.

5) Xác định nồng độ của DIG-dUTP bằng cách sử dụng một pha loãng mẫu dò vừa được điều chế bên cạnh mẫu dò DIG-dUTP chuẩn, nhỏ lên màng (nylon hoặc nitrocellulose), cố định bằng cách chiếu tử ngoại (UV- crosslinking, hãng BioRad...), ngâm rửa (bằng dung dịch A), phong bế bề mặt chưa tiếp xúc (bằng dung dịch B: blocking buffer), cho tiếp xúc với kháng thể (conjugate) đặc hiệu DIG, rửa bỏ các yếu tố không phản ứng và ngâm trong dung dịch phát hiện (bằng detection buffer), hiện màu (cả mẫu thử lẫn mẫu chuẩn) để ước tính nồng độ. Bảo quản ở −20 ºC.

Dung dịch A chứa 100 mM maleic acid, 150 mM NaCl và

3% Tween-20 (v/v). Khử trùng bằng lọc. Cất ở 4 ºC.

Dung dịch B chứa 100 mM maleic acid, 150 mM NaCl và

1% w/v hóa chất phong bế (blocking reagent - Roche Molecular Biochemicals #1096 176). Trước tiên trộn hai chất đầu, chỉnh pH đến 7,5 bằng NaOH 0,1N. Hấp cao áp tiệt trùng. Chờ nguội thì cho thêm blocking reagent 10×. Bảo quản ở 4 ºC.