Subcloning (tạo dòng phụ) là thao tác gắn một phần của DNA đã được dòng hóa bằng một plasmid vector hay một phage vector vào một plasmid riêng biệt, và là kỹ thuật thiết yếu và căn bản trong các trường hợp cần biến nạp đoạn DNA có phân tử lượng lớn, để giải đọc trình tự nucleotide (giải trình DNA) hoặc đưa vào vector phát hiện...
1. Điều chế vector plasmid
Cắt khoảng 2 - 3 µg DNA vector bằng 10 đơn vị enzyme hạn chế. Xác nhận hoàn thành việc phân cắt bằng cách điện di một lượng nhỏ DNA. Nếu cần thiết thì cũng có thể phân tách DNA đã cắt bằng điện di. Nếu đã có hai đầu khác nhau (do cắt bằng 2 enzyme) thì thực hiện chiết xuất bằng phenol-chloroform rồi kết tủa bằng ethanol. Nếu hai đầu giống nhau thì khử bỏ gốc phosphate đầu 5' bằng CIP: thêm 3 µl dung dịch đệm CIP 10×, 1 đơn vị CIP, thêm nước cất cho đủ 30 µl, ủ 37 °C trong 1 giờ. Sau đó chiết xuất và kết tủa DNA như làm ở trên. Hai đầu không giống nhau để DNA vector cũng như DNA cần di nạp không tự khép vòng mà kết nối với DNA di nạp có trật tự (định hướng).
2. Điều chế DNA cần gắn
Nếu hai đầu đoạn DNA cần di nạp là khác nhau thì cần phải dùng linker. Phản ứng trình tự là phosphoryl hóa linker, ligation rồi cắt bằng enzyme hạn chế.
2.1. Phản ứng làm bằng đầu đoạn DNA cần gắn
2.1.1. Đầu 5'
1) Dùng enzyme Klenow hoàn thành đầu dính 5': Trộn 5 µl (~1 µg) DNA, 1 µl dNTP (4 loại, mỗi loại 1 mM), 1 µl dung dịch đệm nick-translation 10×, 2 µl nước cất và 1 µl enzyme Klenow (~ 2 đơn vị) (tổng cộng 10 µl). Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
2) Ủ ở 70 °C trong 5 phút để vô hoạt enzyme Klenow. Để nguyên dịch thực hiện phản ứng kết nối linker.
2.1.2. Đầu 3'
1) Để cắt bỏ đầu dính 3' dùng T4 DNA polymerase: Trộn 10 µl (~1 µg) DNA, 2 µl dung dịch đệm T4 DNA polymerase 10×, 1 µl dNTP (4 loại,
mỗi loại 2 mM), 6 µl nước cất và 1 µl T4 DNA polymerase (~2 đơn vị), ủ ở 37 °C trong 5 phút.
Dung dịch đệm T4 DNA polymerase 10× chứa 0,03 M
Tris-acetic acid (pH 7,9), 0,66 M potassium acetate, 0,1 M magnesium acetate, 5,0 mM DTT và 1 mg/ml BSA.
2) Thêm 1 µl EDTA 0,5 M để dừng phản ứng, chiết xuất phenol- chloroform và kết tủa ethanol.
3) Hòa DNA vào TE hoặc nước cất rồi thực hiện phản ứng kết nối linker.
2.2. Phosphoryl hóa linker (linker phosphorylation)
Trộn 1 µl (~1 µg) linker DNA, 1 µl dung dịch đệm polynucleotide kinase 10×, 7 µl nước cất và 1 µl (10 đơn vị) T4 polynucleotide kinase, cho phản ứng ở 37 °C trong 1 giờ.
Dung dịch đệm polynucleotide kinase 10× chứa Tris-HCl (pH 7,6) 0,66M, ATP 10mM, spermidine 10mM, MgCl2 100mM và DTT 150mM.
2.3. Kết nối linker (linker ligation)
DNA đã hoàn thành đầu (ở 2.1.) 5 µl (0,5 mg), linker DNA đã phosphoryl hóa (ở 2.2.) 5 µl (0,5 mg) và T4 ligase 1 µl (~300 đơn vị), trộn đều cho phản ứng diễn ra ở 22 °C trong 6 giờ hoặc ở 4 °C qua 1 đêm. Phản ứng diễn ra có sự tham gia của ATP cũng đã có sẵn trong dịch phản ứng ở bước 2.2. ở trên.
2.4. Cắt bằng enzyme hạn chế
Do trong dịch chứa nhiều phân tử linker (đã kết nối và chưa kết nối) nên cần một lượng lớn enzyme hạn chế, ủ lâu và dung lượng lớn. Nếu không hoàn thiện bước cắt này thì ở bước sau có thể thu được các clone không mong muốn chỉ chứa các đoạn linker đã kết nối với nhau.
1) Sau khi kết thúc bước ủ linker lysation ở trên, lấy dịch phản ứng đem chiết xuất bằng phenol-chloroform và kết tủa bằng ethanol. Hòa tan DNA với 50 µl nước.
2) Trộn vào 50 µl DNA thu được với 6 µl dung dịch đệm enzyme hạn chế 10× (bán kèm enzyme) và 30 đơn vị enzyme hạn chế.
2.5. Kết nối vector với DNA
1) Trộn 1 µl (0,1 µg) vector DNA, 1 µl (tính theo mol cần gấp 2 - 3 lần DNA vector) DNA cần di nạp, 1 µl dung dịch đệm ligation 10×, 7 µl nước cất và 1 µl (~300 đơn vị) T4 ligase, ủ ở 22 °C trong 3 giờ.
Để nguyên dạng dịch phản ứng, trộn trực tiếp với vi khuẩn khả biến để biến nạp.
2.6. Sàng lọc
Lấy vi khuẩn từ một số khuẩn lạc, cấy vào 1,5 ml môi trường lỏng và ủ một thời gian, thu vi khuẩn để điều chế plasmid. Cắt bằng enzyme hạn chế rồi điện di để kiểm tra kết quả di nạp. Điều này giúp phân biệt các plasmid có kết nối với DNA đích với các plasmid không có DNA đích. Ngoài ra có thể phát hiện DNA hay gen nhờ các phương pháp hybridization.