Giai đoạn 2 được thiết kế nghiên cứu mù có đối chứng.
2.3.2.1. Phân nhóm nghiên cứu:
200 trẻ được phân bổ ngẫu nhiên và đồng đều vào 5 nhóm nghiên cứu kí hiệu B, C, E, N, R với số lượng bằng nhau 40 trẻ/nhóm.
Sơ đồ tuyển chọn và phân nhóm trẻtham gia giai đoạn 2 như sau:
Hình 2.3. Sơ đồ tuyển chọn và phân nhóm đối tượng giai đoạn 2
- Nhóm B: Uống 2 liều vắc xin Rotavin M1 cách nhau 2 tháng hàm lượng 106 FFU/liều
- Nhóm C:Uống 3 liều Rotavin M1 cách nhau 1 tháng hàm lượng 106 FFU/liều
- Nhóm E: Nhóm đối chứng sử dụng 2 liều vắc xin Rotarix
- Nhóm N: Uống 3 liều Rotavin M1 cách nhau 1 tháng hàm lượng 106,3 FFU/liều
- Nhóm R: Uống 2 liều Rotavin M1 cách nhau 2 tháng hàm lượng 106,3 FFU/liều
310 trẻ 6 – 12 tuần tuổi
có cha mẹ đồng ý tham gia
Khám, loại trừ Vào NC: 200 trẻ Nhóm B: 40 trẻ Nhóm C: 40 trẻ Nhóm N: 40 trẻ Nhóm E: 40 trẻ Nhóm R: 40 trẻ 348 trẻ 6 – 12 tuần tuổi ở 15 xã
2.3.2.2. Phương pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắc xin thử nghiệm
Hình 2.4. Sơ đồ uống vắc xin và lấy mẫu xét nghiệm giai đoạn 2 nhóm C, E và N
Hình 2.5. Sơ đồ uống vắc xin và lấy mẫu xét nghiệm giai đoạn 2 nhóm B và R
0 60±3 90±3
Theo dõi hàng ngày
30±3 67±3
7
mẫu phân(7) mẫu phân(7)
Vx 1 MÁU 1 Vx 3 MÁU 3 Vx 2 mẫu phân(7) 37±3 MÁU 2
Lấy mẫu phân khi tiêu chảy
0 60±3 90±3
mẫu phân khi tiêu chảy Theo dõi hàng ngày
30±3 67±3 7 mẫu mẫu Vx MÁU Vx MÁU
Lấy máu lần thứ nhất (M1) ngay trước khi uống vắc xin để làm các xét nghiệm huyết học, sinh hóa: Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, SGOT, SGPT và urê huyết thanh. Xác định hiệu giá kháng thể IgG và IgA đặc hiệu RV nền.
Uống vắc xin Rotavin-M1 liều 1 (1ml/liều hoặc 2ml/liều) thời điểm quyết định uống (ngày 0).
Theo dõi các triệu chứng lâm sàng xuất hiện trong 30 phút đầu và hàng ngày trong vòng 30 ngày sau uống vắc xin theo đúng mẫu qui định;
Uống vắc xin Rotavin-M1 liều 2 (1ml/liều hoặc 2ml/liều sau liều 1) thời điểm quyết định uống (thời điểm 303 hoặc 60+5) (lô vắc xin thử nghiệm đã được chọn uống liều 1);
Theo dõi các triệu chứng lâm sàng xuất hiện trong 30 phút đầu và hàng ngày trong vòng 30 ngày sau uống vắc xin theo đúng mẫu qui định;
Lấy mẫu phân (P) 7 ngày liên tục (7 ngày tính từ sau khi uống vắc xin) và những trường hợp bị tiêu chảy trong thời gian theo dõi, làm xét nghiệm virut Rota đào thải ra phân. Nếu xác định được virut Rota trong phân, sẽ định týp, nếu là G1P [8] sẽ phải xác định là virut vắc xin hay virut hoang dại bằng phương pháp xác định trình tự gen.
Lấy máu lần thứ 2 (M2) ở thời điểm 30+3 ngày sau uống vắc xin liều 2 để xét nghiệm tìm sự biến động hiệu giá kháng thể và xác định Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, SGOT, SGPT và urê huyết thanh sau uống vắc xin liều 2 như M0;
Sau 90 ngày theo dõi an toàn về lâm sàng và cận lâm sàng (so sánh các xét nghiệm huyết học, sinh hóa giữa M0, M2), nếu vắc xin được đánh giá là an toàn, nhóm nghiên cứu sẽ báo cáo với Chủ tịch hoặc Phó chủ tịch Hội đồng Y đức - Bộ Y tế để cho phép tiến hành ngay giai đoạn 3.
2.3.2.3. Chỉ tiêu đánh giá tính an toàn
Giai đoạn 2 đánh giá dựa trên phân tích thống kê bằng so sánh tỷ lệ trẻ bị phản ứng phụ trong 30 ngày sau khi uống mỗi liều vắc xin Rotavin-M1và
phản ứng phụ trong 30 ngày sau khi uống mỗi liều vắc xin Rotavin-M1 giữa nhóm sử dụng vắc xin Rotavin-M1 với nhóm sử dụng vắc xin Rotarix.
Phản ứng tức thì sau uống (phản ứng tại chỗ, toàn thân xảy ra trong vòng 30 phút sau sử dụng vắc xin): nôn hoặc sặc.
Phản ứng tại chỗ, phản ứng toàn thân (kể cả các phản ứng phụ xảy ra ngoài dự kiến xảy ra trong vòng 30 ngày sau khi sử dụng vắc xin): lồng ruột (xảy ra trong vòng 30 ngày sau uống vắc xin, chẩn đoán xác định bằng mổ hoặc chụp X quang, siêu âm), sốt, cáu ngắt, kích thích, chán ăn, nôn, tiêu chảy, xuất tiết đường hô hấp trên (ho và chảy nước mũi), đầy hơi, viêm đường hô hấp dưới (viêm cuống phổi hoặc viêm phế quản). Những phản ứng phụ nghiêm trọng (SAEs) diễn ra từ ngày uống vắc
xin cho đến ngày thứ 30 sau ngày sử dụng vắc xin liều 2: tiêu chảy nặng, viêm dạ dày ruột cấp tính, mất nước, tử vong do lồng ruột hoặc viêm phổi hoặc tiêu chảy mất nước, chứng co giật.
So sánh các xét nghiệm huyết học, sinh hóa trước và sau uống vắc xin.
2.3.2.4. Chỉ tiêu đánh giá tính sinh miễn dịch của vắc xin Rotavin-M1
Đây là chỉ tiêu nghiên cứu ở cả hai giai đoạn 2,3. Tiêu chí đánh giá dựa trên phân tích thống kê bằng cách so sánh tỷ lệ trẻ có chuyển đổi kháng thể trung hòa và kháng thể IgG, IgA của huyết thanh trước khi sử dụng vắc xin và sau 30 + 3 ngày sử dụng uống liều 2 giữa nhóm uống vắc xin Rotavin-M1 với nhóm uống vắc xin Rotarix.
Định nghĩa chuyển đổi kháng thể
Một trẻ không có kháng thể trung hòa hoặc không có kháng thể IgG, IgA virut Rota trước khi sử dụng vắc xin được coi là có sự chuyển đổi kháng thể khi tình trạng kháng thể trong huyết thanh thay đổi từ âm tính sang dương tính.
Đối với trẻ có kháng thể trung hòa hoặc có kháng thể IgG, IgA trước khi uống vắc xin được coi là có sự chuyển đổi kháng thể khi hiệu giá kháng thể trong huyết thanh vào lúc 4-6 tuần sau sử dụng vắc xin cao gấp từ 4 lần trở lên so với trước khi uống vắc xin.
So sánh tỷ lệ đáp ứng miễn dịch giữa các nhóm nghiên cứu và với nhóm đối chứng. Lịch và liều của nhóm có tỷ lệ đáp ứng miễn dịch cao nhất sẽ được chọn để thực hiện giai đoạn 3.
Phương pháp xác định các chỉ tiêu đánh giá tính an toàn
Các triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng xuất hiện trong vòng 30 phút và 28 ngày sau tiêm VX được theo dõi theo đúng quy định của Tổ chức Y tế thế giới (WHO – 1997, 2000) [29], [30].
+ Lâm sàng: Tính an toàn được đánh giá bằng tỷ lệ người xuất hiện phản
ứng phụ trong vòng 30 phút và 28 ngày sau tiêm VX. Công thức:
+ Xét nghiệm: Ngoài các dấu hiệu lâm sàng, tính an toàn còn được đánh
giá thông qua sự biến đổi một số chỉ số sinh hóa, huyết học sau tiêm VX: Hồng cầu, huyết sắc tố, bạch cầu, công thức bạch cầu, tiểu cầu, SGOT, SGPT và urê huyết thanh.
VX được đánh giá đạt yêu cầu về tính an toàn nếu các chỉ số SGOT, SGPT và urê huyết thanh không tăng so với trước tiêm VX.
VX được đánh giá đạt yêu cầu về tính an toàn nếu sau tiêm VX: . Hồng cầu, huyết sắc tố, tiểu cầu không giảm.
Phân tích số liệu:
- Các số liệu được xử lý trên phần mềm Stata 11.0
- Các thông tin định lượng được phân tích bằng thuật toán t-student. Các các tỷ lệ giữa các nhóm được so sánh bằng test khi bình phương có hiệu chỉnh của Fisher.
2.3.2.5. Kỹ thuật nghiên cứu
- Xác định các phản ứng phụ xuất hiện trong 30 phút và 28 ngày sau tiêm VX bằng kỹ thuật khám lâm sàng (do các bác sỹ Trung tâm Y tế huyện Thanh Sơn thực hiện).
- Các xét nghiệm huyết học được thực hiện trên máy BC-1800 và Sysmex KX-21 tại khoa Sinh hóa (Bệnh viện Đa khoa tỉnh Phú Thọ).
- Các xét nghiệm sinh hóa được thực hiện trên máy BS-300 Chemistry Analyzer (Mindray) tại khoa Sinh hóa (Bệnh viện Đa khoa tỉnh Phú Thọ).
- Các xét nghiệm virut Rota trong mẫu phân sử dụng sinh phẩm chẩn đoán ProSpect, Oxoid, Vương Quốc Anh.
- Kỹ thuật xác định genotype G và P của virut của đối tượng sau uống vắc xin được thực hiện tại phòng xét nghiệm Sinh hóa, khoa Sinh học phân tử và miễn Dịch, Viện Vệ Sinh dịch tễ Trung ương sử dụng thường quy đã công bố (Phụ lục) trên máy PCR của hãng Biorad.
- Kỹ thuật giải trình tự gen xác định trình tự gen 9 (VP7) của một số chủng virut G1P[8] phân lập trong phân trẻ uống vắc xin được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh hoá, khoa Miễn dịch và Sinh học phân tử và phòng thí nghiệm hữu nghị NIHE-Nagasaki, Viện Vệ Sinh Dịch tễ trung ương sự dụng máy giải trình tự gen Applied Biosystem 3130, Mỹ.
- Các kỹ thuật ELISA xác định hiệu giá kháng thể IgA và IgG đặc hiệu RV (RV-IgA, RV-IgG) được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hoá Sinh, Viện Vệ Sinh Dịch Tễ TW sử dụng thường quy do phòng thí nghiệm các virut đường ruột tại CDC, Atlanta cung cấp. Trong thường quy này, kháng huyết thanh chuẩn phủ bản được PTN tại CDC cung cấp. Các sinh phẩm bao gồm kháng thể kháng IgA/IgG người gắn biotin, cộng hợp extravidin gắn peroxidasa mua từ công ty KPL và Sigma-Aldrich. Kháng nguyên (virut RRV) và nước nổi nuôi cấy tế bào được sản xuất tại phòng thí nghiệm Hoá Sinh, Viện Vệ Sinh Dịch Tễ.