2.2.1. Các nguyên vật liệu, dụng cụ dùng cho uống văc xin, lấy mẫu và xét nghiệm trong phòng thí nghiệm
Dụng cụ uống vắc xin, lấy máu, xét nghiệm máu, lấy mẫu phân, xét nghiệm phân: Bơm kim tiêm 5ml tiệt trùng, sử dụng 1 lần; Bông cồn, dây garo, kìm kẹp bông; Ống chứa máu, chống đông 5ml; Găng tay cao su; Các dụng cụ xét nghiệm sinh hóa, huyết học; Các nguyên liệu, dụng cụ lấy mẫu phân và bộ sinh phẩm chẩn đoán virut Rota trong mẫu phân (kit ProSpecT, Oxoid, Anh); Các nguyên liệu, dụng cụ định týp virut Rota bằng phương pháp RT-PCR.
2.2.2. Vắc xin thử nghiệm
- Vắc xin thử nghiệm giai đoạn 1: VX Rotavin-M1 do POLYVAC sản xuất từ chủng G1P[8]-WS (KH0118) do chính Polyvac phân lập.
+ Lô số: 032008
+ Hạn sử dụng: 01/2010
+ Dạng bào chế: Đóng lọ 2ml /1 lọ, 1ml/ liều.
+ Kháng nguyên: Chủng virut Rota G1P[8] ít nhất 1.000.000 ffu/mL + Chất ổn định: Đường Sacazoza 35%
+ Kháng sinh: Kanamycin Sulfate: dưới 10μg /liều
- Vắc xin dùng cho giai đoạn 2 và 3: Rotavin M1 lô số 03R2009, hạn sử dụng tháng 07/2011. Các thành phần khác hoàn toàn giống với vắc xin sử dụng ở giai đoạn 1.
- Vắc xin đối chứng: Rotarix, do hãng GSK sản xuất + Lô số:
+ Hạn sử dụng:
+ Dạng bào chế: Chủng G1P[8] hiệu giá tối thiểu 1.000.000 PFU/mL Quản lý và bảo quản vắc xin
Điều kiện vận chuyển
Vắc xin nghiên cứu sẽ được đóng gói và vận chuyển tới trung tâm nghiên cứu theo lịch trình định trước. Với mỗi lần vận chuyển người chịu trách nhiệm quản lý vắc xin sẽ kiểm tra dây chuyền lạnh có được duy trì trong suốt quá trình vận chuyển hay không. Nếu có bất kỳ vấn đề gì, người này sẽ phải thông báo cho giám sát viên nghiên cứu ngay lập tức.
Điều kiện bảo quản
Vắc xin cần phải được bảo quản ở nhiệt độ ≤ - 200C, ở điều kiện tối tránh ánh sáng trong quá trình vận chuyển từ Hà Nội đến Thanh Sơn và bảo quản trong kho. Trong thời gian vận chuyển và cho uống vắc xin tại địa điểm nghiên cứu, phải giữ vắc xin trong thùng lạnh ở nhiệt độ 2-8oC. Nhiệt độ cần phải giám sát và ghi vào biên bản theo dõi trong suốt cuộc thử nghiệm.
Nếu có sự cố về dây chuyền lạnh vắc xin sẽ không được sử dụng. Nghiên cứu viên hoặc người có trách nhiệm phải tiếp xúc với giám sát viên để có quyết định phù hợp. Vắc xin được khuyến cáo sử dụng càng sớm càng tốt sau khi đông tan băng. Nếu lọ vắc xin đã mở mà không sử dụng trong vòng 8 giờ thì phải loại bỏ.
Chủ nhiệm đề tài/nghiên cứu viên chính là người chịu trách nhiệm bảo quản các hồ sơ chính xác về viện nhận và phân phối toàn bộ sản phẩm thử nghiệm. Nghiên cứu viên chỉ cấp vắc xin cho đối tượng được tuyển chọn và nghiên cứu.
Các mẫu về kiểm kê vắc xin sẽ do nghiên cứu viên thiết kế và ghi chép để đảm bảo số lượng vắc xin chính xác. Khi vắc xin được chuyển đến, nghiên cứu viên phải xác nhận số lượng vắc xin nhận được và thông báo lại cho người giám sát nghiên cứu hoặc người được chỉ định biết.
Hồ sơ kiểm kê vắc xin nghiên cứu có cả thông tin người nhận vắc xin, số lượng và ngày phân phối vắc xin, ghi chép lại khi có bất kỳ lọ vắc xin nào được hoàn trả hoặc không được dùng đến. Hồ sơ này sẽ được gộp cùng với bất kỳ thông tin kiểm kê vắc xin nào được ghi chép lại trong phiếu điều tra. Những hồ sơ này sẽ được giám sát viên hoặc cán bộ kiểm tra của POLYVAC kiểm tra ngay lập tức hoặc sẽ được kiểm tra theo thẩm quyền qui định khác vào bất cứ lúc nào.
Khi hoàn trả lại vắc xin, nghiên cứu viên phải ký vào sổ ghi chép việc trả lại vắc xin nghiên cứu để xác định rằng toàn bộ các lọ vắc xin chưa được sử dụng hay đã được sử dụng một phần đã được hoàn trả và không còn có lọ vắc xin nghiên cứu nào còn sót lại trong tay nghiên cứu viên. Một bản sao toàn bộ hồ sơ kiểm kê và cam kết về việc hoàn trả vắc xin được nghiên cứu viên lưu giữ trong hồ sơ nghiên cứu.
Tại thời điểm kết thúc nghiên cứu, ngoại trừ có qui định cụ thể khác, toàn bộ vắc xin chưa được sử dụng kể cả các lọ vắc xin đã được sử dụng một phần và sổ ghi chép kiểm kê vắc xin được chuyển cho POLYVAC.
Kiểm định chất lượng vắc xin
Trước khi triển khai nghiên cứu, hiệu giá của vắc xin cần được kiểm định bởi POLYVAC. Trong thời gian nghiên cứu địa điểm nghiên cứu lâm sàng, cần lấy mẫu nghiên cứu các lọ vắc xin chưa sử dụng để chuyển về POLYVAC làm thử nghiệm kiểm tra hiệu giá để xác nhận việc bảo quản có ảnh hưởng đến hiệu giá vắc xin hay không.
2.2.3. Vật liệu thu thập thông tin nghiên cứu
Phiếu nghiên cứu (case report form)
Là hồ sơ tập hợp đầy đủ các thông tin cần thiết cho từng đối tượng nghiên cứu sẽ được thông kê nghiên cứu sử dụng để tổng hợp và phân tích số liệu. Tất cả thông tin sẽ được thu thập bởi nghiên cứu viên/người được chỉ định bao gồm: Tên, tuổi, ngày sinh, tình trạng sức khoẻ, mã số quản lý, mã số vắc xin trẻ uống (đối với nghiên cứu trên nhóm trẻ, ngày (giờ) uống vắc xin, các phản ứng sau uống (nếu có) đáp ứng miễn dịch.
Sau khi sàng lọc, thăm khám, uống vắc xin, nghiên cứu viên phải ghi đầy đủ thông tin vào các mục yêu cầu trong Phiếu nghiên cứu cho từng đối tượng. Các mẫu phiếu thu thập thông tin trong nghiên cứu sẽ được thiết kế và cấp phát trước khi triển khai nghiên cứu địa điểm nghiên cứu.
Tất cả các số liệu về phản ứng phô được thu thập tại các trung tâm y tế. Các tham số về kháng huyết thanh Rota được thu thập tại phòng Xét nghiệm. Số liệu của mỗi đối tượng được ghi trong phiếu điều tra.
Phiếu theo dõi phản ứng (Diary card)
Phiếu này là công cụ để đối tượng nghiên cứu, có thể tự theo dõi, ghi lại các phản ứng xảy ra sau uống vắc xin 30 ngày tại gia đình. Phiếu sẽ được cấp phát ngay sau khi sử dụng vắc xin, người nhận phiếu cần được hướng dẫn, giải thích cách ghi lại. Kết thúc thời kỳ theo dõi, ở lần thăm 2, đối tượng nghiên cứu, nộp lại phiếu cho nghiên cứu viên để nghiên cứu viên hoặc người có trách nhiệm kiểm tra và chuyển thông tin thu được vào phiếu điều tra cho từng đối tượng.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu giai đoạn 1
Là nghiên cứu mở, không đối chứng 2.3.1.1. Cỡ mẫu
Theo cỡ mẫu cho nghiên cứu thử nghiệm địa điểm nghiên cứu lâm sàng giai đoạn 1 là 30 người.
2.3.1.2. Phân nhóm đối tượng
Hình 2.1. Sơ đồ tuyển chọn và phân nhóm đối tượng giai đoạn 1 (nhóm A)
40 người 18 – 40 tuổi
Khám, loại trừ
Nhóm A
30 người, uống vắc xin Rotavin-M1 2 liều cách nhau 1 tháng
- Cung cấp thông tin cơ bản về VX và nội dung, các bước thử nghiệm. Trả lời mọi thắc mắc của người tình nguyện. Thu đơn tình nguyện tham gia nghiên cứu của 40 người (theo mẫu quy định).
- Khám và tuyển chọn 30 người vào nghiên cứu. Mỗi đối tượng được uống 2 liều vắc xin Rotavin-M1 cách nhau 30 + 3 ngày.
2.3.1.3. Tiến trình thực hiện giai đoạn 1
Hình 2.2. Sơ đồ uống vắc xin và lấy mẫu theo dõi an toàn giai đoạn 1
Lấy máu lần thứ nhất (Mo) ngay trước khi uống vắc xin để làm các xét nghiệm huyết học, sinh hóa: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, SGOT, SGPT và urê huyết thanh;
Uống vắc xin Rotavin-M1 liều 1 (2ml/liều) ở thời điểm quyết định uống vắc xin Rotavin-M1 (ngày 0);
Theo dõi các triệu chứng lâm sàng xuất hiện trong 30 phút đầu và đến ngày thứ 30 sau sử dụng vắc xin theo đúng mẫu qui định;
Lấy máu lần thứ 2 (M2) ở thời điểm ngay trước khi uống vắc xin liều 2 để làm các xét nghiệm huyết học, sinh hóa (tương tự MO);
Uống vắc xin Rotavin-M1 liều 2 (2ml/liều), cách uống vắc xin liều 1 từ 30 + 3 ngày.
Lấy máu lần thứ 3 (M3) sau khi uống vắc xin liều 2 từ 30 + 3 ngày để làm các xét nghiệm huyết học, sinh hóa (tương tự, M2).
Ngày 0 M1, V1 M2, V2 M3
10 ngày 10 ngày Ngày
60±5 Ngày 30±3 Lấy mẫu phân hàng ngày Lấy mẫu phân các đợt tiêu chảy Lấy mẫu phân hàng ngày Lấy mẫu phân các đợt tiêu chảy
Lấy mẫu phân (P) 10 ngày liên tục (10 ngày tính từ sau khi uống mỗi liều vắc xin) và những trường hợp bị tiêu chảy trong thời gian theo dõi, làm xét nghiệm virut Rota đào thải ra phân. Nếu xác định được virut Rota trong phân, sẽ định týp, nếu là G1P[8] sẽ phải xác định là virut vắc xin hay virut hoang dại bằng phương pháp xác định trình tự gen và kỹ thuật tạo đám hoại tử để xác định virut còn sống hay đã chết.
2.3.1.4. Tiêu chuẩn đánh giá tính an toàn giai đoạn 1
Tính an toàn của vắc xin Rotavin-M1: bao gồm các phản ứng tại chỗ, phản ứng toàn thân và sự biến động của các chỉ số men gan SGOT, SGPT sau mỗi liều uống, khả năng đào thải virut vắc xin ở người tình nguyện.
Vắc xin được đánh giá là an toàn khi đáp ứng được các tiêu chí sau đây: - Không có tác dụng phụ nặng, nghiêm trọng: Sốc, tụt huyết áp, tử vong... - Không gây độc cho gan: SOGT, SGPT không tăng sau uống VX.
- Không gây độc cho thận: Urê huyết thanh không tăng sau uống VX. - Các chỉ số hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu... không thay đổi sau uống VX. - Không hoặc có ít tác dụng phụ toàn thân và tại chỗ sau uống VX: sốt, dị ứng, đau cơ khớp, nôn, tiêu chảy...
Phương pháp xác định các chỉ tiêu đánh giá tính an toàn
Các triệu chứng lâm sàng, cận lâm sàng xuất hiện trong vòng 30 phút và 28 ngày sau uống VX được theo dõi theo đúng quy định của Tổ chức Y tế thế giới (WHO – 1997, 2000) [29], [30].
+ Lâm sàng: Tính an toàn được đánh giá bằng tỷ lệ người xuất hiện phản
ứng phụ trong vòng 30 phút và 28 ngày sau uống VX. Công thức: Số người uống VX có phản ứng phụ
Tỷ lệ phản ứng phụ (%) = 100 Tổng số người uống VX
+ Xét nghiệm: Ngoài các dấu hiệu lâm sàng, tính an toàn còn được
VX: Hồng cầu, huyết sắc tố, bạch cầu, công thức bạch cầu, tiểu cầu, SGOT, SGPT và urê huyết thanh.
VX được đánh giá đạt yêu cầu về tính an toàn nếu các chỉ số SGOT, SGPT và urê huyết thanh không tăng so với trước uống VX.
VX được đánh giá đạt yêu cầu về tính an toàn nếu sau uống VX: . Hồng cầu, huyết sắc tố, tiểu cầu không giảm.
. Sự biến động của bạch cầu, công thức bạch cầu. Phân tích số liệu:
- Các số liệu được xử lý trên phần mềm Stata 9.1
- Các thông tin định lượng được phân tích bằng thuật toán t-student.
2.3.1.5. Kỹ thuật nghiên cứu
- Xác định các phản ứng phụ xuất hiện trong 30 phút và 28 ngày sau uống VX bằng kỹ thuật khám lâm sàng (do các bác sỹ Trung tâm Y tế huyện Thanh Sơn thực hiện).
- Các xét nghiệm huyết học được thực hiện trên máy UNFPA BC- 1800 và Sysmex KX-21 tại khoa Sinh hóa (Bệnh viện Đa khoa Thanh Sơn, Phú Thọ).
- Các xét nghiệm sinh hóa được thực hiện trên máy BS-300 Chemistry Analyzer (Mindray) tại khoa Sinh hóa (Bệnh viện Đa khoa Thanh Sơn, Phú Thọ).
- Các xét nghiệm kháng nguyên virut Rota trong mẫu phân của đối tượng sau uống vắc xin bằng kỹ thuật Elisa được thực hiện tại khoa Sinh học phân tử và miễn Dịch, Viện Vệ Sinh dịch tễ Trung ương.
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu giai đoạn 2.
Giai đoạn 2 được thiết kế nghiên cứu mù có đối chứng.
2.3.2.1. Phân nhóm nghiên cứu:
200 trẻ được phân bổ ngẫu nhiên và đồng đều vào 5 nhóm nghiên cứu kí hiệu B, C, E, N, R với số lượng bằng nhau 40 trẻ/nhóm.
Sơ đồ tuyển chọn và phân nhóm trẻtham gia giai đoạn 2 như sau:
Hình 2.3. Sơ đồ tuyển chọn và phân nhóm đối tượng giai đoạn 2
- Nhóm B: Uống 2 liều vắc xin Rotavin M1 cách nhau 2 tháng hàm lượng 106 FFU/liều
- Nhóm C:Uống 3 liều Rotavin M1 cách nhau 1 tháng hàm lượng 106 FFU/liều
- Nhóm E: Nhóm đối chứng sử dụng 2 liều vắc xin Rotarix
- Nhóm N: Uống 3 liều Rotavin M1 cách nhau 1 tháng hàm lượng 106,3 FFU/liều
- Nhóm R: Uống 2 liều Rotavin M1 cách nhau 2 tháng hàm lượng 106,3 FFU/liều
310 trẻ 6 – 12 tuần tuổi
có cha mẹ đồng ý tham gia
Khám, loại trừ Vào NC: 200 trẻ Nhóm B: 40 trẻ Nhóm C: 40 trẻ Nhóm N: 40 trẻ Nhóm E: 40 trẻ Nhóm R: 40 trẻ 348 trẻ 6 – 12 tuần tuổi ở 15 xã
2.3.2.2. Phương pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắc xin thử nghiệm
Hình 2.4. Sơ đồ uống vắc xin và lấy mẫu xét nghiệm giai đoạn 2 nhóm C, E và N
Hình 2.5. Sơ đồ uống vắc xin và lấy mẫu xét nghiệm giai đoạn 2 nhóm B và R
0 60±3 90±3
Theo dõi hàng ngày
30±3 67±3
7
mẫu phân(7) mẫu phân(7)
Vx 1 MÁU 1 Vx 3 MÁU 3 Vx 2 mẫu phân(7) 37±3 MÁU 2
Lấy mẫu phân khi tiêu chảy
0 60±3 90±3
mẫu phân khi tiêu chảy Theo dõi hàng ngày
30±3 67±3 7 mẫu mẫu Vx MÁU Vx MÁU
Lấy máu lần thứ nhất (M1) ngay trước khi uống vắc xin để làm các xét nghiệm huyết học, sinh hóa: Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, SGOT, SGPT và urê huyết thanh. Xác định hiệu giá kháng thể IgG và IgA đặc hiệu RV nền.
Uống vắc xin Rotavin-M1 liều 1 (1ml/liều hoặc 2ml/liều) thời điểm quyết định uống (ngày 0).
Theo dõi các triệu chứng lâm sàng xuất hiện trong 30 phút đầu và hàng ngày trong vòng 30 ngày sau uống vắc xin theo đúng mẫu qui định;
Uống vắc xin Rotavin-M1 liều 2 (1ml/liều hoặc 2ml/liều sau liều 1) thời điểm quyết định uống (thời điểm 303 hoặc 60+5) (lô vắc xin thử nghiệm đã được chọn uống liều 1);
Theo dõi các triệu chứng lâm sàng xuất hiện trong 30 phút đầu và hàng ngày trong vòng 30 ngày sau uống vắc xin theo đúng mẫu qui định;
Lấy mẫu phân (P) 7 ngày liên tục (7 ngày tính từ sau khi uống vắc xin) và những trường hợp bị tiêu chảy trong thời gian theo dõi, làm xét nghiệm virut Rota đào thải ra phân. Nếu xác định được virut Rota trong phân, sẽ định týp, nếu là G1P [8] sẽ phải xác định là virut vắc xin hay virut hoang dại bằng phương pháp xác định trình tự gen.
Lấy máu lần thứ 2 (M2) ở thời điểm 30+3 ngày sau uống vắc xin liều 2 để xét nghiệm tìm sự biến động hiệu giá kháng thể và xác định Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, SGOT, SGPT và urê huyết thanh sau uống vắc xin liều 2 như M0;
Sau 90 ngày theo dõi an toàn về lâm sàng và cận lâm sàng (so sánh các xét nghiệm huyết học, sinh hóa giữa M0, M2), nếu vắc xin được đánh giá là an toàn, nhóm nghiên cứu sẽ báo cáo với Chủ tịch hoặc Phó chủ tịch Hội đồng Y đức - Bộ Y tế để cho phép tiến hành ngay giai đoạn 3.
2.3.2.3. Chỉ tiêu đánh giá tính an toàn
Giai đoạn 2 đánh giá dựa trên phân tích thống kê bằng so sánh tỷ lệ trẻ bị phản ứng phụ trong 30 ngày sau khi uống mỗi liều vắc xin Rotavin-M1và
phản ứng phụ trong 30 ngày sau khi uống mỗi liều vắc xin Rotavin-M1 giữa nhóm sử dụng vắc xin Rotavin-M1 với nhóm sử dụng vắc xin Rotarix.
Phản ứng tức thì sau uống (phản ứng tại chỗ, toàn thân xảy ra trong vòng 30 phút sau sử dụng vắc xin): nôn hoặc sặc.
Phản ứng tại chỗ, phản ứng toàn thân (kể cả các phản ứng phụ xảy ra ngoài dự kiến xảy ra trong vòng 30 ngày sau khi sử dụng vắc xin): lồng ruột (xảy ra trong vòng 30 ngày sau uống vắc xin, chẩn đoán xác định bằng mổ hoặc chụp X quang, siêu âm), sốt, cáu ngắt, kích thích, chán ăn,