PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2. Phương pháp xác định thành phần loài nấm Colletotrichum hại ớt
Sử dụng 2 phương pháp chiết DNA mẫu nấm theo qui trình đã được công bố. - Phương pháp 1 (CTAB): sử dụng đệm CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) theo qui trình của Doyle & Doyle (1987). Khoảng 50 mg tản nấm thuần nuôi cấy trên môi trường PDA được nghiền bằng chày nhựa chuyên dụng (Kontes™ Pellet Pestle) với 0,5 mL đệm CTAB trong ống Eppendorf loại 1,5 ml.
DNA được chiết một lần với Chloroform: isoamyl alcohol (24:1). Cặn DNA được rửa hai lần bằng ethanol 70% và hũa trong 30 àl nước cất 2 lần vụ trựng.
Mẫu DNA được bảo quản ở -20oC.
- Phương pháp 2 (NaOH): là phương pháp chiết nhanh bằng NaOH được biến đổi theo phương pháp của Wang et al. (1993). Tản nấm thuần (khoảng 50 mg) trờn mụi trường PDA được cho vào ống Eppendorf 1,5 ml chứa 50 àl NaOH 0,5 M và được nghiền bằng đầu tip loại 100 - 200 àL. Dịch nghiền, 5àl, được chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml chứa 50 àl đệm Tris 0,1M, pH 8. Mẫu DNA được bảo quản ở -20oC.
3.3.2.2. Phản ứng PCR
Hai phản ứng PCR xác định thành phần loài được thực hiện bởi các cặp mồi được trình bày tại bảng 3.1. Mỗi phản ứng PCR có tổng thể tích 25,0 μl chứa 11,0 àl nước siờu sạch (Invitrogen), 13,5 àl GoTaq Green Master Mix (Promega), 0,5 àl DNA (chiết bằng CTAB), 0,5 àl mỗi loại mồi (ITS4 & ITS5;
AM-F & AM-R).
Bảng 3.1. Các mồi được sử dụng trong định danh phân tử nấm Colletotrichum
Mồi Trình tự(5’-3’) Sản phẩm (bp)
Vùng
gen Tham khảo AM-F TCATTCTACGTATGTGCCCG
~ 910 ApMat Silva et al.
(2012) AM-R CCAGAAATACACCGAACTTGC
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
~ 500 ITS White et al.
(1990) ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.) với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở 94oC trong 2 phút; tiếp theo là 35 chu trình phản ứng gồm biến tính ở 94oC trong 30 giây, gắn mồi ở 52oC (với cặp mồi ITS4 & ITS5) và 54oC với cặp mồi (AM-F & AM-R) trong 30 giây, tổng hợp sợi ở 72oC trong 1 phút. Phản ứng được kết thúc với 5 phút ở 72oC
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% đươc chuẩn bị bằng đệm TAE (Tris Acetic acid EDTA) và chứa 0,5 mg/mL ethidium bromide. Gel được chạy trên thiết bị điện di Mupid-exU Mini System (Helixxtec) với đệm TAE ở điện thế 100 V trong 30 - 40 phút. Bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và được chụp bằng máy ảnh số.
3.3.2.3. Phương pháp tinh chiết DNA, giải trình tự và phân tích trình tự
Sau khi điện di, DNA được cắt và bảo quản trong các ống effendorf mới.
Mỗi mẫu được cắt bằng dao khác nhau thành hình chữ nhật có chứa DNA. Sử dụng kít GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) để tinh chiết DNA từ gel agarose. Tất cả các bước tinh sạch được thực hiện ở nhiệt độ phòng.
Sản phẩm PCR tinh chiết được giải trình tự trực tiếp cả 2 chiều dùng mồi PCR tại hãng Macrogen (Hàn Quốc).
Các chuỗi mẫu được xác định danh tính khi so sánh với các chuỗi đã công bố từ trước nhờ phần mềm tìm kiếm BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
Phân tích trình tự và xây dựng cây phả hệ được thực hiện bằng phần mềm ClustalX 2.0 (Larkin et al., 2007) và Mega 6.0 (Tamura et al., 2013).
3.3.2.4. Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu phục vụ chẩn đoán nhanh các loài Colletotrichum
Dựa trên các trình tự gen đã công bố về các loài chuẩn (Cannon et al., 2012;
Damm et al., 2012a, 2012b; Weir et al., 2012), các mồi đặc hiệu cho các loài nấm chính gây hại trên ớt được thiết kế.
Các trình tự lựa chọn sẽ được phân tích bằng phần mềm ClustalX 2.0 (Larkin et al., 2007) để tìm các vị trí thiết kế mồi phù hợp.
Các loài nấm được thiết kế mồi đặc hiệu gồm: C. gloeosporioides s.s, C. truncatum, C. fructicola, C. siamense.
3.3.2.5. Phương pháp tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi cho các mồi đặc hiệu
Các phản ứng PCR tối ưu hóa nhiệt độ được thực hiện trên các mẫu nấm đại
diện cho các loài đã được định danh. Mỗi phản ứng PCR có tổng thể tích 15,0 μl chứa 6,6 àl nước siờu sạch (Invitrogen), 7,5 àl Itaq Green Master Mix, 0,3 àl DNA (chiết bằng CTAB), 0,6 àl mỗi loại mồi tự thiết kế (0,3 àl mồi F, 0,3 àl mồi R).
Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.) với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở 94oC trong 2 phút, tiếp theo là 35 chu trình phản ứng gồm biến tính ở 94oC trong 35 giây, gắn mồi ở các nhiệt độ 54oC, 58oC và 62oC với cặp mồi (F & R) trong 30 giây, tổng hợp sợi ở 72oC trong 35 giây. Phản ứng được kết thúc với 5 phút ở 72oC.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% được chuẩn bị bằng đệm TAE (Tris Acetic acid EDTA) và chứa 0,5 mg/mL ethidium bromide. Gel được chạy trên thiết bị điện di Mupid-exU Mini System (Helixxtec) với đệm TAE ở điện thế 100 V trong 30 - 40 phút. Bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và được chụp bằng máy ảnh số. Xác định nhiệt độ gắn mồi thích hợp cho từng loại mồi thiết kế dựa trên hình ảnh thu được sau điện di.
3.3.2.6. Phương pháp tối ưu hóa phương pháp chiết DNA phục vụ chẩn đoán nhanh các loài Colletotrichum
Các phản ứng PCR tối ưu hóa phương pháp chiết được thực hiện trên các mẫu nấm đại diện cho các loài đã được định danh. DNA của các mẫu nấm đại diện được chiết theo 2 phương pháp (trình bày tại mục 3.3.2.1). Mỗi phản ứng PCR có tổng thể tớch 15,0 μl chứa 6,6 àl nước siờu sạch (Invitrogen), 7,5 àl Itaq Master Mix, 0,3 àl DNA, 0,6 àl mỗi loại mồi tự thiết kế (0,3 àl mồi F; 0,3 àl mồi R).
Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.) với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở 94oC trong 2 phút, tiếp theo là 35 chu trình phản ứng gồm biến tính ở 94oC trong 35 giây, gắn mồi ở nhiệt độ 58oC (các cặp mồi C.glo-F-R và C.tru-F/-R) và 62oC (các cặp mồi C.fruc-F1/-R1 và C.sia- F1/-R1) trong 30 giây, tổng hợp sợi ở 72oC trong 35 giây. Phản ứng được kết thúc với 5 phút ở 72oC.
Điện di các sản phẩm PCR được thực hiện tương tự thí nghiệm tối ưu hóa nhiệt độ. Nhiệt độ gắn mồi của các phản ứng là nhiệt độ thích hợp nhất đã được xác định cho từng mồi thiết kế. Đánh giá hiệu quả của các phương pháp chiết thông qua hình ảnh thu được sau điện di.
3.3.2.7. Phương pháp xác định thành phần, mức độ phân bố và đa dạng loài Colletotrichum tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh bằng PCR
Các phản ứng PCR xác định thành phần loài được thực hiện trên 52 mẫu nấm
thu thập tại ĐBSH và một số tỉnh. Đầu tiên, các mẫu nấm được kiểm tra PCR bằng cặp mồi C.sia-F1/-R1. Tiếp theo các mẫu nấm âm tính với cặp mồi này lại được kiểm tra lần lượt bằng các cặp mồi C.fruc-F1/-R1, C.glo-F-R và C.tru-F/-R theo phương pháp loại trừ. DNA của các mẫu nấm đại diện được chiết bằng phương pháp sử dụng NaOH (trình bày tại mục 3.3.2.1). Mỗi phản ứng PCR có tổng thể tớch 15,0 μl chứa 6,6 àl nước siờu sạch (Invitrogen), 7,5 àl Itaq Master Mix, 0,3 àl DNA, 0,6 àl mỗi loại mồi tự thiết kế (0,3 àl mồi F; 0,3 àl mồi R).
Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.) với điều kiện sau: khởi đầu biến tính ở 94oC trong 2 phút, tiếp theo là 35 chu trình phản ứng gồm biến tính ở 94oC trong 35 giây, gắn mồi ở nhiệt độ 58oC (các cặp mồi C.glo-F-R và C.tru-F/-R) và 62oC (các cặp mồi C.fruc-F1/-R1 và C.sia- F1/-R1) trong 30 giây, tổng hợp sợi ở 72oC trong 35 giây. Phản ứng được kết thúc với 5 phút ở 72oC.
Điện di các sản phẩm PCR được thực hiện tương tự thí nghiệm tối ưu hóa nhiệt độ. Thành phần loài, mức độ phân bố và đa dạng loài Colletotrichum tại ĐBSH và một số tỉnh được xác định dựa trên kết quả điện di.