4.2. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI NẤM Colletotrichum HẠI ỚT TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG VÀ MỘT SỐ TỈNH
4.2.2. T ổng kết thành phần loài Colletotricum phát hiện trên cây ớt tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh
Dựa trên phân tích phân tử, ít nhất 5 loài Colletotrichum đã được phát hiện thấy gây bệnh thán thư ớt tại ĐBSH. Các đặc điểm tản nấm, hình thái bào tử phân sinh, đĩa áp của 5 loài được minh họa ở hình 4.6 và được mô tả tóm tắt dưới đây.
Loài C. gloeosporioides s.s. Tản nấm màu xanh xám, mặt dưới có màu xám nhạt đến hồng nhạt. Trong điều kiện nhiệt độ 25oC, tản nấm mọc kín đĩa (90 mm) sau 7 ngày nuôi cấy. Sợi nấm khí sinh màu trắng, mọc dày đặc. Bào tử phân sinh
đơn bào, hỡnh trụ, hai đầu tự tới trũn, kớch thước 11,0 - 12,0 ì 3,4 - 4,3 àm. Đĩa áp màu nâu đến nâu đậm, hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng khụng đều, kớch thước 7,3 - 9,5 ì 4,5 - 5,3 àm (hỡnh 4.6 A).
Loài C. siamense: Tản nấm lúc đầu màu trắng, bông xốp, sau đó dần chuyển sang màu phớt hồng, mặt dưới có màu vàng nhạt đến phớt hồng. Ở điều kiện nhiệt độ 25oC, tản nấm mọc kín đĩa (90 mm) sau 7 ngày nuôi cấy. Bào tử hình thành dày đặc trên bề mặt tản nấm và tạo thành các khối màu vàng gạch. Bào tử phân sinh đơn bào, hình trụ, hai đầu tù tới tròn, kích thước kích thước 10,6 - 12,6 × 3,6 - 5,1 àm. Đĩa ỏp màu nõu đến nõu đậm, hỡnh trứng, tày, elip tới gần hỡnh thoi, một số cú hỡnh dạng khụng đều, kớch thước 6,7 - 8,8 ì 4,6 - 6,1 àm (hỡnh 4.6 B).
Loài C. fructicola: Tản nấm lúc đầu màu trắng xám, bông xốp, sau đó phần trung tâm đĩa chuyển sang màu xám đậm, mặt dưới có màu xám đậm ở giữa và màu trắng xám ở xung quanh. Ở điều kiện nhiệt độ 25oC, tản nấm mọc kín đĩa (90 mm) sau 7 ngày. Bào tử phân sinh đơn bào, hình trụ, hai đầu tù tới tròn, kích thước kớch thước 11,2 - 12,5 ì 3,6 - 4,9 àm. Đĩa ỏp màu nõu đến nõu đậm, hỡnh trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều, kích thước 6,7 - 8,2 ì 5,1 - 6,2 àm (hỡnh 4.6 C).
Loài C. aeschynomenes: Tản nấm màu trắng, tản nấm bông xốp, mặt dưới có vàng nhạt ở giữa và màu trắng xám ở xung quanh. Ở điều kiện nhiệt độ 25oC, tản nấm mọc kín đĩa (90 mm) sau 7 ngày. Bào tử hình thành dày đặc trên bề mặt tản nấm tạo thành màu vàng cam hoặc màu vàng cam đậm. Bào tử phân sinh đơn bào, hỡnh trụ, hai đầu tự tới trũn, kớch thước kớch thước 11,9 ± 1,1 ì 4,6 ± 0,4 àm.
Đĩa áp màu nâu đến nâu đậm, hình trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số chẻ thựy, kớch thước 9,7 ± 1,4 x 5,7 ± 0,6 àm (hỡnh 4.6 D).
Loài C. truncatum: Tản nấm có màu xám đậm, mặt dưới có màu xám đậm ở giữa và màu xám ở xung quanh. Ở điều kiện nhiệt độ 25oC, tản nấm mọc kín đĩa (90 mm) sau 9 ngày. Bào tử hình thành dày đặc trên bề mặt tản nấm tạo thành khối màu nâu đậm. Bào tử phân sinh đơn bào, cong hình lưỡi liềm, thót nhọn ở hai đầu, kớch thước 20,5 - 22,4 ì 3,5 - 4,1 àm. Đĩa ỏp màu nõu đến nõu đậm, hỡnh trứng, tày, elip tới gần hình thoi, một số có hình dạng không đều, kích thước 8,1 - 11,7 ì 5,1 - 6,3 àm (hỡnh 4.6 E).
Kết quả quan sát các đặc điểm hình thái của 5 loài nấm Colletotrichum phát hiện được hoàn toàn phù hợp với công bố của các tác giả Cannon et al. (2008), Damm et al. (2009), Prihattusi et al. (2009) và Weir et al. (2012).
Chú thích: A - C. gloeosporioides s.s (mẫu C44), B - C. siamense (mẫu C4), C - C. fructicola (mẫu C1), D - C. aechynomenes (mẫu C29), E - C. truncatum (mẫu C30). Ký tự a và b lần lượt là mặt trên và mặt
dưới của tản nấm trên môi trường PDA sau cấy 7 ngày, c và d lần lượt là bào tử phân sinh và đĩa áp.
Thanh bar: 10 àm.
Hình 4.6. Đặc điểm hình thái 5 loài Colletotrichum gây bệnh thán thư ớt xác định được tại đồng bằng sông Hồng và một số tỉnh
4.2.3. Phát triển kỹ thuật PCR chẩn đoán nhanh các loài nấm Colletotrichum gây hại trên cây ớt
4.2.3.1. Thiết kế mồi đặc hiệu chẩn đoán nhanh loài Colletotrichum a. Xác định vùng thiết kế mồi phù hợp
Việc chẩn đoán đúng các loài nấm nói chung và loài Colletotrichum nói riêng có vai trò quan trọng không những về mặt khoa học mà còn trong thực tiễn quản lý bệnh vì quan hệ giữa nấm với cây ký chủ cũng như tính mẫn cảm với thuốc hóa học khác nhau theo loài. Theo Cannon et al. (2000) và Hyde et al.
(2009b), định danh các loài Colletotrichum dựa vào đặc điểm hình thái thường không chính xác do sự phụ thuộc cao về đặc điểm hình thái vào điều kiện môi trường. Vì vậy, phân tích phân tử đã ngày càng trở nên quan trọng và được xem là chuẩn vàng trong phân loại nhóm nấm này.
Hiện nay, các cặp mồi được sử dụng phổ biến để chẩn đoán các loài Colletotrichum là ITS, ApMat (White et al., 1990; Silva et al., 2012). Các cặp mồi này cho kết quả chẩn đoán chính xác nhưng chi phí thường cao. Vì vậy, việc thiết kế các mồi đặc hiệu phục vụ chẩn đoán các loài Colletotrichum phổ biến tại ĐBSH nói riêng và tại Việt Nam nói chung là hết sức cần thiết.
Dựa vào mức độ phổ biến của các loài Colletotrichum phát hiện được tại ĐBSH và một số tỉnh, mồi đặc hiệu để chẩn đoán nhanh 4 loài nấm phổ biến là C. truncatum, C. gloeosporioides s.s, C. siamense và C. fructicola đã được thiết kế. Kết quả cụ thểnhư sau:
Đối với loài C. truncatum, kết quả giải trình tự gen vùng ITS xác định được vùng gen này hoàn toàn có thể lựa chọn để thiết kế mồi đặc hiệu vì chứa nhiều vị trí khác biệt đặc trưng cho loài này. Vùng ITS của loài này đã được căn trình tự đa chuỗi với 7 loài Colletotrichum đã được công bố gây bệnh thán thư ớt và 2 vùng thiết kế mồi đã được lựa chọn (bảng 4.12).
Kết quả căn trình tự đa chuỗi thu được cho thấy, trình tự phần đầu 3’ ở vùng thiết kế mồi xuôi dòng của loài C. truncatum rất khác biệt so với trình tự tương ứng của các loài trong phân tích.
Bảng 4.12. Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C. truncatum dựa trên trình tự ITS của các loài Colletotrichum đã được công bố gây bệnh thán thư ớt
TT Loài Mã GenBank Vùng thiết kế mồi xuôi dòng
Vùng thiết kế mồi ngược dòng
1. C.coccodes HM171679 (T) GGTGCCGCCTGCGGACCC--CCC CCCTACGGTTGA-CGTAGG 2. C.dematum GU227819 (T) GTTCCC--TCGCGGAACC---CC CCCTACGGTTAAACGTAGG 3. C.fructicola JX010165 (T) GTCTCC---GCGAC---CC CCCTACAGCTGA-TGTAGG 4. C.gloeosporioides JX010152 (T) GTCTCC---GCGAC---CC CCCTACAGCCGA-TGTAGG 5. C.siamense JX010171 (T) GTCTCC---GCGAC---CC CCCTACAGCTGA-TGTAGG 6. C.acutatum AF411700 (T) GAAGCCTCTCGCGGGCCT-CCCC CCCCACGG-AGA-CGTGGG 7. C.simmondsii JQ948276 (T) GAAGCCTCTCGCGGGCCTTCCCC CCCCACGGCACA-CGTGGG 8. C.truncatum GU227862 (T) GTCCCC--TAAAAAGGAC--GTC CTCTACGGTTGA-CGTAGG * ** * * ** * * ** **
Chú thích: (T) là mẫu chuẩn của loài. Dấu * chỉ các vị trí đồng nhất
Đối với 3 loài C. gloeosporioides s.s, C. siamense và C. fructicola của phức hợp loài C. gloeosporioides s.l, do trình tự ITS của chúng quá bảo thủ nên trình tự vùng ApMat (Silva et al., 2012) đã được sử dụng để thiết kế mồi đặc hiệu. Trình tự ApMat của 28 loài thuộc phức hợp loài C. gloeosporioides s.l đã được căn trình tự đa chuỗi và 2 vùng thiết kế mồi phù hợp nhất cho mỗi loài đã được lựa chọn (bảng 4.13, bảng 4.14 và bảng 4.15).
Bảng 4.13. Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C. gloeosporioides s.s dựa trên trình tự ApMat của phức hợp loài C. gloeosporioides s.l
TT Loài Mã GenBank Vùng thiết kế mồixuôi dòng Vùng thiết kế mồingược dòng
1. C.nupharicola JX145319 (T) ACTCTTGCCACAGCATGCG-GG CCGTTCCATGACTGATACTAC 2. C.alienum KM360144 (T) ACTCTTGCCACAGCATGCG-GG CCGTTCCATGACTGATACTAC 3. C.aenigma KM360143 (T) ACTCTTGCCACAGCATGCG-GG CCGTTCCATGACTGATACTAC
4. C.musae KC888926 (T) ACTCTTGCCACAGCATGCG-GG CAGTTCCATGACTGATACTAC
5. C.aeschynomenes KM360145 (T) ACTCTTGCTACAGCATGCG-GC TCGTTTCGTGGCTGTTGCTAC 6. C.melanocaulon JX145313 (T) ACTCTTGCTGCAGCATGCG-GG CCGTTTCGTGGCAGATGCTAC 7. C.salsolae KC888925 (T) ACTCTTGCTGCAGCATGCG-GG CCGTTTCGTGGCAGATGCTAC 8. C.queensl&icum KC888928 (T) ACTCTTGCTGCAGCATGCG-GG CCGGTTCGTGGCTGATGCTAC 9. C.asianum FR718814 (T) GCTCTTGCTGCAGCATGCG-GG CCGTTTCGTGGCTGATGCTAC 10. C.tropicale KC790728 (T) GCTCTTGCCGCAGCATGCGAGA CCGTTTCGTGGCTGATGCTAC 11. C.alatae KC888932 (T) ACTCTTTCCGCAGCATGCG-GG CTGTTTCGTGACCGATGCCAC 12. C.kahawae JQ894579 (T) AGTCTTGCCGCGGCCCGCG-GG CCATGTCGTGGCTGATGCAAC 13. C.temperatum JX145298 (T) AGTCTTGCCGCGGCCCGCG-GG CCATGTCGTGGCTGATGCAAC 14. C.rhexiae JX145290 (T) AGTCTTGCCGCGGCCCGCG-GG CCATGTCGTGGCTGATGCAAC 15. C.jiangxiense KJ954607 (T) AGTCTTGCCGCGGCCCGCG-GG CCATGTCGTGGCTGATGCAAC 16. C.camelliae KJ954497 (T) AGTCTTGCCGCGGCCCGCG-GG CCATGTCGTGGCTGATGCAAC 17. C.clidemiae KC888929 (T) AGTCTTGCCGCAGCCCGCG-GG CCATGTCGTGGCTGATGCAAC 18. C.psidii KC888931 (T) AGTCTTGCCGCGGCCCGCG-CG CCATGTCGTGGTTGATGCAAC 19. C.cordylinicola JQ899274 (T) AGTCTTGCCGCGGCCCGCG-GG CCATGTCGTGGCTGATGCAAC
20. C.ti KM360146 (T) AGTCTTGCCGCAGCCCGCG-GG CCATGTCGTGGCTGAAGCAAC
21. C.aotearoa KC888930 (T) AGTCTTGCCGTAGCCCGCG-GG CCATGTCGTGGCTGATGCAAC 22. C.henanense KJ954524 (T) AGCCTTTCCGCAGCATGCG-GG CCGTTTCGTGGCTGATGCTAC 23. C.horii JQ807840 (T) ACTCTTGAAGCAGAATGCG-GG CGGTTTCGTGGTTGATGCCGC 24. C.xanthorrhoeae KC790689 (T) ACTCTTGCCGCAACATGCG-GG CCGTTTCGTGGCTGATGCTAC 25. C.theobromicola KC790726 (T) ACTCTAACCGCAACTTGCG-GG CCGCTCTGTGGCTGATGCTAC 26. C.fructicola JQ807838 (T) ACTCTTGCCACAGCATGCG-GG CCGTTCCATGACTGATACTAC 27. C.siamense JQ899289 (T) ACTCTTGCTGCAGCATGCG-GG CCGTTTCGTGGCAGATGCTAC 28. C.gloeosporioides JQ807843 (T) ACTCTTGCCGCAGCATATA-GG CCAATTCGTTGCTGATGCTAC
** * * * *
Chú thích: (T) là mẫu chuẩn của loài. Dấu * chỉ các vị trí đồng nhất
74
Bảng 4.14. Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C. siamense dựa trên trình tự ApMat của phức hợp loài C. gloeosporioides s.l TT Loài Mã GenBank Vùng thiết kế mồi xuôi dòng Vùng thiết kế mồi ngược dòng
1. C.nupharicola JX145319 (T) AGACAGTGGC---TGGGCATCA AGCGTTCGTACGTCTAAGTATC 2. C.alienum KM360144 (T) AGACAGTGGC---TGGGCATCA AGCGTTCGTACGTCTAAGTATC 3. C.aenigma KM360143 (T) AGACAGTGGC---TGGGCATCA AGCGTTCGTACGTCTAAGTATC 4. C.musae KC888926 (T) AGACAGTGGC---TGGGCATCA AGCGTTCGCACGTCGAAGTATC 5. C.aeschynomenes KM360145 (T) AGACAGTGGC---TGGGCATCA TGCGTTCGCACGCCTAAGTTTC 6. C.melanocaulon JX145313 (T) TGACAGCGGC---TGCGTATCG TGCATTCGTACGCCTAAGTATC 7. C.salsolae KC888925 (T) TGACAGTGGC---TGTGTATCG TGCGTTCGTACGCCTAAGTATC 8. C.queensl&icum KC888928 (T) TGACAGCGGC---TGTGTATCG TGCGTTCGCACGCCTAAGTATC 9. C.asianum FR718814 (T) TGACAGCGGC---TGTGTATCG TGCGTTCGTACGCCTCAGTATC 10. C.tropicale KC790728 (T) TGACAGCGGC---TGTGTATCG AGCGTTCTTACGTTTAAGTTTC 11. C.alatae KC888932 (T) AGACAGTGGC---TGGGCAACA AGCGTTCGTACGTGCAAGTGTC 12. C.kahawae JQ894579 (T) TGGCAGTGGC---TGGGCATCA AGCGGTCATACGCCAAAGCATC 13. C.temperatum JX145298 (T) TGGCAGTGGC---TGGGCATCA AGCGGTCATACGCCAAAGCATC 14. C.rhexiae JX145290 (T) TGGCAGTGGC---TGGGCATCA AGCGGTCATACGCCAAAGCATC 15. C.jiangxiense KJ954607 (T) TGGCAGTGGC---TGGGCATCA AGCGGTCATACGCCAAAGCATC 16. C.camelliae KJ954497 (T) TGGCAGTGGC---TGGGCATCA AGCGGTCATACGCCAAAGCATC 17. C.clidemiae KC888929 (T) TGGCATTGGC---TGGGCATCA AGCGGTCATACGCCAAAGCATC 18. C.psidii KC888931 (T) TGGCAGTGGC---TGGGCATCA AGCGGTCATACGCCAAAGCATC 19. C.cordylinicola JQ899274 (T) TGGCAGTGGC---TGGGCATCA AGCGGTCATACGCCAAAGCATC 20. C.ti KM360146 (T) TGGCAGTGGC---TGGGCATCA AGCGGTCATACGCCAAAGCATC 21. C.aotearoa KC888930 (T) TAGCAGTGGC---TAGGCATCA AGCGGTCATACGCCAAAGCACC 22. C.henanense KJ954524 (T) TGGCAGTGGCGGAGTATCGGTATCA AGCGGTCGTACGCCTAAGCATC 23. C.horii JQ807840 (T) TGACAGTGGC---CGGGTATCA AGCGATCGTGCGCCTAGGCATC 24. C.xanthorrhoeae KC790689 (T) TGACAGTGGC---TGGGTATCA AGCGGTCGTACGCCTAAGTAGC 25. C.theobromicola KC790726 (T) TGATGATGGC---TACATATCG AGCGATGGTACACCTGACCATC 26. C.fructicola JQ807838 (T) AGACAGTGGC---TGGGCATCA AGCGTTCGTACGTCTAATTATC 27. C.siamense JQ899289 (T) TGACAGCGGC---TGTGTATCG TGCATTCGTACGCCTAAGTATC 28. C.gloeosporioides JQ807843 (T) TGA--- AGCGTTCGTACGTCTAAGTATC ** * ** **
Chú thích: (T) là mẫu chuẩn của loài. Dấu * chỉ các vị trí đồng nhất
75
Bảng 4.15. Vùng thiết kế mồi phát hiện loài C. fructicola dựa trên trình tự ApMat của phức hợp loài C. gloeosporioides s.l
TT Loài Mã GenBank Vùng thiết kế mồi xuôi dòng Vùng thiết kếmồi ngược dòng
1. C.nupharicola JX145319 (T) CATCAAATC----GAAGATCTCTGC GAACACAAGGACGACCTAAAG 2. C.alienum KM360144 (T) CATCAAATC----GAAGATCTCTGC GAACACAAGGACGACCTAAAG 3. C.aenigma KM360143 (T) CATCAAATC----GAAGATCTCTGC GAACACAAGGACGACCTAAGG 4. C.musae KC888926 (T) CATCAAATC----GAAGATCTCTGC GAACACAAGGACGACCTAGAG 5. C.aeschynomenes KM360145 (T) CATCAAATC----GAAGATCCCTGG GGACACAAAGACAACCTGAGG 6. C.melanocaulon JX145313 (T) CATTAAATC----GAAGATCTCTGG GGACACAAAGACAACCTTAGG 7. C.salsolae KC888925 (T) CATTAAATC----GAAGATCTCTGG GGACACAAAGACAACCTGAGG 8. C.queensl&icum KC888928 (T) CATTAAATC----GAAGATCCCTGG GGACATAAAGACAACTTGAGG 9. C.asianum FR718814 (T) CATTAAATC----GAAGATCCCTGG GGATACACAGACAACCTGAGG 10. C.tropicale KC790728 (T) CATTAAATC----GAAGATCCCTGG GGACACAAGGACAGCCTGAGG 11. C.alatae KC888932 (T) TATTAAATC----GAAGATCTCTGG GGACATAGAGACAGCTTCATG 12. C.kahawae JQ894579 (T) CATTAAATC--AAAAAAATCTCTGG GGATACAAAGACAACCTAATG 13. C.temperatum JX145298 (T) CATTAAATC--AAAAAAATCTCTGG GGATACAAAGACAACCTAATG 14. C.rhexiae JX145290 (T) CATTAAATC--AAAAAAATCTCTGG AGATACAAAGACAACCTAATA 15. C.jiangxiense KJ954607 (T) CATTAAATC--AAAAAAATCTCTGG GGATACAAAGACAACCTAATG 16. C.camelliae KJ954497 (T) CATTAAATC--AAAAAAATCCCTGG GGATACAAAGACAACCTAATG 17. C.clidemiae KC888929 (T) CCTTAAATC-AAAAAAAATCTCTGG GGATACAAAGACAAACTAATG 18. C.psidii KC888931 (T) CATTAAATCAAAAAAAAATCTCTGG GGATACAAAGACAAACTAATG 19. C.cordylinicola JQ899274 (T) CATTAAAAC--AAAAAAATCTCTGG GGATACAAAGACAACCTAATG
20. C.ti KM360146 (T) CATTAAATC---AAAAAATCTCTGG GGATACAAAGACAACCTAATG
21. C.aotearoa KC888930 (T) CATTAAATC---AAAAAATCTCTGG GGATACAAAGACAACCTAATG 22. C.henanense KJ954524 (T) CATTAAATC----AAAGATCTCTGG GGATAAAAAGACCACCTGGTG 23. C.horii JQ807840 (T) CATCAAATC----AAATATCTCTGG GGATACAAAGACATTCTCATG 24. C.xanthorrhoeae KC790689 (T) TATTAAATC----AAAGATCTCTGG GGATACAAAGACAGCCCAATG 25. C.theobromicola KC790726 (T) GACTAAATC----AAAACTCTCCGG GGATACAAAGACAACCCAATG 26. C.fructicola JQ807838 (T) CATCAAATC----GAAGATCTCTGC GAACACAAGGACGACCTAAAG 27. C.siamense JQ899289 (T) CATTAAATC----GAAGATCTCTGG GGACACAAAGACAACCTTAGG 28. C.gloeosporioides JQ807843 (T) CATCAAATC----GAAGATCTCTGG GGGCACAAAGACAACCTAAGG
*** ** * * * * **
76
b. Xác định các tham số của các mồi được thiết kế
Dựa trên trình tự của các vùng lựa chọn, các cặp mồi đặc hiệu cho 4 loài Colletotrichum đã được thiết kế (bảng 4.16). Một loạt các tham số liên quan đến chất lượng của mồi cũng đã được xác định dựa theo các hướng dẫn về thiết kế mồi PCR (Dieffenbach et al., 1993; Judelson, 2006; Rychlik et al., 1990).
Độ dài mồi: Tất cả các mồi đều có kích thước 18 - 22 nucleotide. Các kích thước này nằm trong phạm vi phù hợp của mồi: đủ dài để đảm bảo tính đặc hiệu và đủ ngắn để mồi gắn đễ dàng vào khuôn (bảng 4.16).
Nhiệt độ tách sợi: (Tm = Melting Temperature). Hai cặp mồi C.sia-F1/-R1 và C.glo-F/-R có nhiệt độ tách chuỗi từ 51,6 - 53,8oC, nằm trong phạm vi phù hợp 50 - 60oC. Hai cặp mồi còn lại, C-tru-F-/R và C.fru-F1/-R1 có nhiệt độ tách sợi thấp hơn từ 41,2 - 49oC (bảng 4.16).
Nhiệt độ gắn mồi: (Ta = annealing temperature). Nhiệt độ gắn mồi là một trong các tiêu chí quan trọng, được tính dựa trên nhiệt độ tách sợi. Nhiệt độ gắn mồi quá cao làm mồi khó gắn vào khuôn dẫn tới năng suất PCR thấp. Nhiệt độ gắn mồi quá thấp làm mồi dễ gắn không đặc hiệu vào khuôn dẫn tới tạo các sản phẩm không đặc hiệu. Một trong các công thức phổ biến nhất nhằm xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu của cặp mồi là: Ta = 0,3 × Tm (của mồi có nhiệt độ tách sợi thấp hơn) + 0,7 Tm (của sản phẩm) -14,9 (Rychlik et al., 1990). Sử dụng công thức này trong phần mền PrimerSelect (DNASTAR inc.), nhiệt độ gắn mồi tối ưu của 4 cặp mồi thiết kế đã được xác định là từ 53 - 55,9oC, nằm trong phạm vi phù hợp 50 - 60oC (bảng 4.16).
Hàm lượng GC: Hàm lượng các gốc G và C của các mồi thiết kế từ 42,9 - 57,9% nằm trong phạm vi phù hợp 40 - 60% (bảng 4.16).
Mấu GC đầu 3’: Tất cả 7 mồi thiết kế ngoại trừ mồi C.sia-R1 đều có ở đầu 3’ là G hoặc C hoặc GC hoặc CG hoặc GG. Mấu GC cho phép mồi bám đặc hiệu vào khuôn (bảng 4.16).
Độ ổn định đầu 3’: Khoảng 5 nucleotide (pentamer) đầu 3’ cần có độ ổn định phù hợp để gắn đặc hiệu vào khuôn. Giá trị ΔG của 5 nucleotide đầu 3’ của tất cả các mồi thiết kế có giá trị từ -10,5 kcal/mol đến -7,1 kcal/mol, nằm trong ngưỡng giới hạn tối đa ≥ -12 kcal/mol (bảng 4.16).
Bảng 4.16. Đặc điểm 4 cặp mồi được thiết kế nhằm phát hiện C. truncatum, C. fructicola, C. siamense và C. gloeosporioides s.s
Mồi Trình tự (5’-3’)
Độ dài mồi (nu)
Mấu GC đầu 3’
Hàm lượng GC (%)
Nhiệt độ tách
mồi (OC)
ΔG pentamer
đầu 3' (kcal/mol)
ΔG cấu trúc kẹp tóc tối đa (kcal/mol)
ΔG tự mồi tối đa (kcal/
mol)
ΔG tự mồi chéo
tối đa (kcal/mol)
Nhiệt độ gắn mồi tối
ưu (OC)
Độ dài sản phẩm
(bp)
C.tru-F GTCCCCTAAAAAGGACGTC 19 C 52,6 47,7 -9,4 -1,9 -4,4
-2,9 53 321
C.tru-R CCTACGTCAACCGTAGAG 18 G 55,6 42,2 -7,1 -3,1 -2,5
C.fruc-F1 CATCAAATCGAAGATCTCTGC 21 GC 42,9 49,0 -9,9 1,1 -2,8
-0,2 55,3 307
C.fruc-R1 CTTTAGGTCGTCCTTGTGTTC 21 C 47,6 48,2 -8,2 1,2 0,3
C.sia-F1 TGACAGCGGCTGTGTATCG 19 CG 57,9 52,8 -9 0,8 -3
-0,4 54,2 345
C.sia-R1 GATACTTAGGCGTACGAATGCA 22 Không 45,5 51,6 -10,5 2 -5,9
C.glo-F ACTCTTGCCGCAGCATATAGG 21 GG 52,4 53,8 -8,1 0,8 -0,1
-2 55,9 211
C.glo-R GTAGCATCAGCAACGAATTGG 21 GG 47,6 52,5 -10,4 2 -0,4
Chú thích: Các tham số nhiệt động học của mồi gồm nhiệt độ tách mồi, ΔG pentamer đầu 3’, ΔG cấu trúc kẹp tóc tối đa, ΔG tự mồi tối đa và ΔG tự mồi chéo tối đa được xác định dùng phần mềm VectorNTI Advance 11.5 (Invitrogen), trong đó ΔG là năng lượng tự do Gibbs. Nhiệt độ gắn mồi tối ưu được xác định bằng phần mềm PrimerSelect
(DNASTAR, Inc.).
78
Cấu trúc thứ cấp: Cấu trúc thứ cấp có thể hình thành trong cùng một mồi hoặc giữa 2 mồi. Mồi chứa cấu trúc thứ cấp xấu thường dẫn tới năng suất PCR bị giảm, thậm chí không có sản phẩm. Tính ổn định của cấu trúc thứ cấp được đo bằng năng lượng tự do Gibbs ΔG (là năng lượng cần để phá vỡ cấu trúc thứ cấp).
Các loại cấu trúc thứ cấp là:
+ Cấu trúc kẹp tóc (Hairpins). Là cấu trúc thứ cấp hình thành trong nội bộ mồi. Tất cả các mồi thiết kế đều có giá trị ΔG tối đa từ -3 kcal/mol đến 2 kcal/mol, nằm trong ngưỡng giới hạn tối đa ≥ -5 kcal/mol (bảng 4.16).
+ Tự mồi (Self Dimer). Là cấu trúc hình thành giữa các phân tử của cùng loại mồi. Tất cả các mồi thiết kếđều có giá trị ΔG tối đa từ -5,9 kcal/mol đến 0,3 kcal/mol, nằm trong ngưỡng giới hạn tối đa ≥ -6 kcal/mol (bảng 4.16).
+ Tự mồi chéo (Cross Dimer). Là cấu trúc hình thành giữa các phân tử của 2 mồi khác nhau (cặp mồi trong phản ứng PCR). Tất cả các mồi thiết kế đều có giá trị ΔG tối đa từ -0,4 kcal/mol đến -0,2 kcal/mol, nằm trong ngưỡng giới hạn tối đa ≥ -6 kcal/mol (bảng 4.16).
Như vậy, dựa vào vùng trình tự ITS và ApMat đã thiết kế được 4 cặp mồi C.sia-F1/-R1, C.glo-F/-R, C-tru-F-/R và C.fru-F1/-R1. Các cặp mồi này sẽ được dùng để xác định các loài nấm C. gloeosporioides s.s, C. fructicola, C. siamense và C. truncatum gây bệnh thán thư ớt.
4.2.3.2. Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho các cặp mồi thiết kế
Một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tính đặc hiệu và hiệu suất của mồi là nhiệt độ gắn mồi. Mặc dù nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho 4 cặp mồi đã được xác định bằng phần mềm nhưng chúng cần phải được xác định bằng thực nghiệm. Sử dụng DNA được chiết từ các mẫu nấm đã được xác định danh tính, phản ứng PCR đã được thực hiện ở 3 ngưỡng nhiệt độ là 54oC, 58oC và 62oC nhằm xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho 4 cặp mồi thiết kế. Kết quả kiểm tra PCR (bảng 4.17, hình 4.7 và phụ lục 2) cho thấy:
Cặp mồi C.tru-F và C.tru-R (đặc hiệu loài C. truncatum) có khả năng phát hiện đặc hiệu loài này ở phạm vi nhiệt độ rất rộng. Ở cả 3 ngưỡng nhiệt độ, cặp mồi này chỉ tạo băng sản phẩm mong muốn 321 bp đối với 2 mẫu C30 và C25 (C. truncatum). Băng đặc hiệu tạo ra ở nhiệt độ 58oC và 62oC đậm hơn 54oC (bảng 4.17, hình 4.7).
Bảng 4.17. Xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp của 4 cặp mồi thiết kế Cặp mồi Loài nấm kiểm tra Băng PCR đặc hiệu ở các ngưỡng nhiệt độ
54oC 58oC 62oC
C.tru-F/-R
C. truncatum ++ +++ +++
C. fructicola - - -
C. siamense - - -
C. gloeosporioides s.s - - -
C. aeschynomenes - - -
C.fruc-F1/-R1
C. truncatum - - -
C. fructicola + +++ +++
C. siamense - - -
C. gloeosporioides s.s - - -
C. aeschynomenes - - -
C.sia-F1/-R1
C. truncatum +++ + -
C. fructicola +++ - -
C. siamense +++ +++ +++
C. gloeosporioides s.s +++ - -
C. aeschynomenes +++ - -
C.glo-F/-R
C. truncatum - - -
C. fructicola - - -
C. siamense - - -
C. gloeosporioides s.s ++ +++ +++
C. aeschynomenes - - -
Chú thích: (-): không xuất hiện băng đặc hiệu; (+, ++, +++): mức độ đậm của băng đặc hiệu
Tương tự, cặp mồi C.glo-F và C.glo-R (đặc hiệu loài C. gloeosporioides s.s) cũng có khả năng phát hiện đặc hiệu loài nấm này ở cả 3 ngưỡng nhiệt độ, chỉ tạo băng sản phẩm mong muốn 211 bp đối với 2 mẫu C9 và C44 (C. gloeosporioides s.s). Băng đặc hiệu tạo ra ở nhiệt độ 58oC và 62oC đậm hơn 54oC (bảng 4.17, hình 4.7).
Đối với cặp mồi C.fruc-F1 và C.fruc-R1 (đặc hiệu loài C. fructicola), ở nhiệt độ gắn mồi 54oC, băng đặc hiệu 307 bp mặc dù chỉ hình thành ở 2 mẫu C1 và C14 (C. fructicola) nhưng mờ, có lẽ do hình thành nhiều sản phẩm tự mồi hoặc tự mồi chéo (dimer). Ngoài ra, ở ngưỡng nhiệt độ này, cặp mồi cũng tạo sản phẩm không đặc hiệu ~ 800 bp đối với mẫu C29 (C. aeschynomenes) và ~150 bp đối với mẫu C25 (C. truncatum). Ở nhiệt độ gắn mồi 58oC, cặp mồi đã tạo băng đặc hiệu rõ đối với 2 mẫu C1 và C14 (C. fructicola) chứng tỏ mức độ hình thành dimer đã
giảm. Tuy nhiên, ở ngưỡng nhiệt độ 58oC, cặp mồi cũng tạo băng sản phẩm đặc hiệu rất mờ đối với mẫu C44 (C. gloeosporioides s.s). Khi tăng nhiệt độ lên 62oC, cặp mồi này chỉ tạo băng đặc hiệu và rõ đối với 2 mẫu C1 và C14 và không tạo bất kỳbăng sản phẩm nào đối với các mẫu Colletotrichum khác (bảng 4.17, hình 4.7).
Đối với cặp mồi C.sia-F1 và C.sia-R1 (đặc hiệu loài C. siamense), phản ứng PCR ở nhiệt độ gắn mồi 54oC đã tạo băng đặc hiệu 345 bp với tất cả các mẫu nấm. Ở nhiệt độ gắn mồi 58oC, cặp mồi này đã tạo băng đặc hiệu rõ đối với 2 mẫu C4 và C33 (C. siamense) và rất mờ đối với mẫu C30 (C. truncatum). Ở ngưỡng nhiệt độ 58oC, cặp mồi cũng tạo băng sản phẩm không đặc hiệu đối với mẫu C1 (C. fructicola) và C44 (C. gloeosporioides s.s). Khi tăng nhiệt độ gắn mồi lên 62oC, cặp mồi này đã tạo băng đặc hiệu, rõ đối với 2 mẫu C4 và C33 (C. siamense). Ở nhiệt độ gắn mồi 62oC, cặp mồi vẫn tạo băng không đặc hiệu đối với mẫu C1 (C. fructicola), tuy nhiên băng này có thể phân biệt được với băng đặc hiệu (bảng 4.17, hình 4.7).
Dựa vào các kết quả trên, nhiệt độ gắn mồi tối ưu đối với các cặp mồi C.tru-F/- R, C.glo-F/-R được xác định là 58 - 62oC, đối với các cặp mồi C.fru-F1/-R1, C.sia- F1/-R1 là 62oC.
Chú thích: Mũi tên chỉ băng sản phẩm mong muốn cho từng cặp mồi Các giếng là các mẫu nấm đã xác định danh tính: C25 và C30 (C. truncatum), C1 và C14 (C. fructicola), C4 và C33 (C. siamense),
C9 và C44 (C. gloeosporioides s.s), C29 (C. aeschynomenes)
Hình 4.7. PCR xác định nhiệt độ gắn mồi phù hợp cho 4 cặp mồi đặc hiệu Colletotrichum