PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học, tính gây bệnh của các loài Colletotrichum
3.3.3.1. Phương pháp chuẩn bị môi trường
- Thành phần của các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu:
+ Môi trường PDA (Potato-Glucose-Agar): 250 gam khoai tây, 20 gam glucose, 20 gam agar và 1.000 ml nước cất.
+ Môi trường PCA (Potato-Carrot-Agar): 20 gam khoai tây, 20 gam cà rốt, 20 gam agar và 1.000 ml nước cất.
+ Môi trường WA (Water-Agar): 20 gam agar và 1.000 ml nước cất.
- Cách chế tạo môi trường PDA: Khoai tây rửa sạch, gọt vỏ, cân đủ lượng rồi thái nhỏ thành miếng vuông với kích thước khoảng 1cm2. Sau đó đun khoai tây cho đến khi mềm, lọc bằng vải màn để lấy dịch chiết khoai tây. Pha 1 lít dịch nước khoai tây với 20g đường và 20g thạch rau câu. Môi trường được đổ vào các bình tam giác, lắc đều rồi đem hấp vô trùng trong nồi hấp ở 121oC (1,5 atm) trong 45-50 phút, để môi trường nguội khoảng 60 - 65oC đem rót vào các đĩa petri đã được hấp vô trùng.
Các môi trường khác được điều chế tương tự như môi trường PDA.
3.3.3.2. Phương pháp đánh giá đặc điểm hình thái
a. Phương pháp đánh giá đặc điểm tản nấm và hình dạng bào tử
Nấm được nuôi cấy trên môi trường PDA ở 25oC ± 2oC trong 5 ngày dưới ánh sáng huỳnh quang liên tục. Nấm đang sinh trưởng ở rìa tản nấm được cấy truyền sang đĩa PDA mới (chuyển bằng một viên tản nấm 4 mm) và ủ ở cùng điều kiện. Đường kính, màu sắc tản nấm, sự hình thành bào tử trên tản nấm được đánh giá sau cấy 3, 5, 7 và 9 ngày. Tại ngày thứ 7, kích thước và hình dạng của bào tử được kiểm tra và đánh giá. Mỗi mẫu nấm đánh giá 3 lần lặp (3 đĩa PDA);
mỗi đĩa PDA đánh giá 30 bào tử (Cai et al., 2009; Than et al., 2008b).
b. Phương pháp quan sát đĩa áp (Appressoria)
Sử dụng kỹ thuật cấy trên lam để quan sát hình thái đĩa áp (hình 3.1). Một mảnh môi trường PDA (1 cm2) được đặt trên đĩa petri vô trùng. Cấy bào tử nấm vào cạnh của miếng môi trường và đậy một lamen vô trùng lên trên miếng môi trường. Ủ đĩa 5 - 7 ngày ở 25o C cho tới khi đĩa áp hình thành ở mặt dưới của lam. Quan sát đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước của đĩa áp) (Cai et al., 2009; Johnston & Jones, 1997).
Hình 3.1. Kỹ thuật cấy trên lam để quan sát hình thái đĩa áp nấm Colletotrichum
Nguồn: Cai et al. (2009) 3.3.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum
Các mẫu nấm được sử dụng trong nghiên cứu là 5 mẫu nấm đã được định danh gồm: C. fructicola (C1), C. siamense (C4), C. aeschynomenes (C29), C. truncatum (C30) và C. gloeosporioides s.s (C44).
Thí nghiệm gồm 5 công thức, từ CT1 đến CT5 tương ứng với 5 loài nấm:
C. gloeosporioides s.s, C. siamense, C. fructicola, C. aeschynomenes, C. truncatum và được bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (completely randomized design - CRD), lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 đĩa.
Các loài nấm được nuôi cấy trên các môi trường PDA, PCA và WA trong điều kiện 25oC ± 2oC, 12 giờ chiếu sáng/ ngày. Tiến hành theo dõi tốc độ phát triển tản nấm và số lượng bào tử hình thành ở các thời điểm 3, 5, 7 và 9 ngày sau cấy của các mẫu nấm để đánh giá khả năng sinh trưởng của chúng trên từng loại môi trường.
Phương pháp theo dõi tốc độ phát triển tản nấm: tiến hành đo đường kính của 3 tản nấm của 3 đĩa petri/ lần nhắc theo hai đường kính vuông góc kẻ ở mặt sau của đĩa ở các thời điểm 3, 5, 7 và 9 ngày sau cấy. Đường kính tản nấm thu được là giá trị trung bình của các lần nhắc.
Phương pháp theo dõi số lượng bào tử hình thành:
Trên từng loại môi trường, sau cấy 3, 5, 7 và 9 ngày, lấy 1 cm2 tản nấm (từ sát mép ngoài tản nấm về phía tâm của đĩa nuôi cấy)/ 1 lần nhắc. Tản nấm sau khi cắt được cho vào tuýp eppendorf có thể tích 1,5 ml và bổ sung 1 ml nước cất vô trùng, ngâm khoảng 30 phút, sau đó lắc nhẹ để bào tử rời khỏi tản nấm và phát tán vào trong nước. Đếm số lượng bào tử sinh ra trên các loại môi trường bằng cách lấy giá trị trung bình của 3 lần quan sát.
Sử dụng buồng đếm vi sinh vật để xác định lượng bào tử trong dung dịch.
Buồng đếm có 25 ô vuông lớn, mỗi ô vuông lớn có 16 ô vuông nhỏ. Buồng đếm có độ sâu 0,1mm và có diện tích 1 mm2.
Thể tích 1 ô vuông lớn = 1/25 mm2 × 1/10 mm = 1/250 mm3 = 1/250 × 10-
3 cm3 = 4. 10-6 ml.
Lấy dung dịch bào tử nấm cho vào buồng đếm, đặt buồng đếm lên kính hiển vi quang học, đếm tổng số bào tử của 5 ô vuông lớn theo đường chéo góc, tính số bào tử trung bình có trong 1 ô vuông lớn, ký hiệu là A.
A
Số bào tử/ ml (A) = = 0,25.A. 106
4 x 10-6
Số bào tử/ 1ml chính là lượng bào tử sinh ra trên tản nấm thu được trên môi trường nuôi cấy.
3.3.3.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum trên môi trường PDA
Các mẫu nấm được sử dụng trong nghiên cứu là 5 mẫu nấm đã được định danh gồm: C. fructicola (C1), C. siamense (C4), C. aeschynomenes (C29), C. truncatum (C30) và C. gloeosporioides s.s (C44).
Thí nghiệm gồm 4 công thức, từ CT1 đến CT4 tương ứng với các mức nhiệt độ 20oC, 25oC, 30oC, 35oC và được bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (completely randomized design - CRD), lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 đĩa.
Các loài nấm được nuôi cấy trên các môi trường PDA ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau trong điều kiện 12 giờ chiếu sáng/ ngày.
Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá được thực hiện tương tự thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng.
3.3.3.5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường đến khả năng sinh trưởng của các loài Colletotrichum trên môi trường PDA
Các mẫu nấm được sử dụng trong nghiên cứu là 5 mẫu nấm đã được định danh gồm: C. fructicola (C1), C. siamense (C4), C. aeschynomenes (C29), C. truncatum (C30) và C. gloeosporioides s.s (C44).
Thí nghiệm gồm 4 công thức, từ CT1 đến CT4 tương ứng với các ngưỡng pH: 4,0; 5,0; 6,0, 7,0 và được bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (completely randomized design - CRD), lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 đĩa.
Các loài nấm được nuôi cấy trên các môi trường PDA trong điều kiện 25oC ± 2oC, 12 giờ chiếu sáng/ ngày.
Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá được thực hiện tương tự thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng.
3.3.3.6. Phương pháp xác định tính gây bệnh của các mẫu nấm Colletotrichum đại diện
Các giống ớt sử dụng lây bệnh nhân tạo (Demon, Lai 20, Chìa vôi, Sussan’Joy) được trồng trong nhà lưới. Lá ớt được lựa chọn là các lá bánh tẻ (khoảng 4 tuần tuổi). Quả ớt xanh và chín sử dụng trong lây bệnh được xác định dựa vào thời gian từ ra hoa đến thu hoạch quả. Cụ thể: Quả xanh: thu ở thời điểm 45 - 50 ngày sau đậu quả; Quả chín: thu ở thời điểm 60 - 65 ngày sau đậu quả.
Các loại quả của các cây ký chủ dễ nhiễm bệnh thán thư được sử dụng lây bệnh: Xoài đốc, chuối tây Thái Lan và chuối tiêu hồng.
Mẫu nấm sử dụng trong thí nghiệm là 5 loài nấm đã được định danh là C. fructicola (C1), C. siamense (C4), C. aeschynomenes (C29), C. truncatum (C30) và C. gloeosporioides s.s (C44).
Các isolate nấm đại diện sẽ được đánh giá tính gây bệnh trên quả ớt theo phương pháp đã được mô tả của Montri et al. (2009) và Than et al. (2008b).
- Lây bệnh cho các loài Colletotrichum đại diện trên ớt: Chọn các lá, quả ớt không bị nhiễm bệnh để lây bệnh. Tiến hành lây bệnh trên lá, quả ớt xanh và chín, mỗi isolate tiến hành lây 10 quả, lá/ 1 giống ớt, 3 lần nhắc lại.
- Lây bệnh các loài Colletotrichum đại diện trên một số loại quả được xem là hay bị nhiễm bệnh thán thư: chọn các quả xoài, chuối tiêu, chuối tây không bị nhiễm bệnh để lây bệnh. Tiến hành lây bệnh trên quả xanh và quả chín, mỗi isolate tiến hành lây 3 quả/ 1 giống (xoài, chuối tây, chuối tiêu), 3 lần nhắc lại.
- Tiến hành: Nấm được nuôi cấy trên môi trường PCA ở 25 - 30oC dưới ánh sáng huỳnh quang liên tục trong 7 ngày. Bào tử nấm được thu, hòa trong nước cất vô trùng và điều chỉnh để đạt nồng độ 106 bào tử/ ml.
- Phương pháp lây bệnh:
+ Lây bệnh có tổn thương: Các bộ phận lây bệnh được khử trùng bề mặt bằng NaOCl 1% trong 5 phút, rửa lại 2 lần bằng nước cất vô trùng, thấm khô. Tạo tổn thương ở giữa quả bằng cỏch dựng kim đục 1 lỗ nhỏ. Nhỏ 6 àl dịch bào tử vào vị trớ gây tổn thương. Ủ quả, lá lây nhiễm ở 25 - 28oC, độ ẩm 100%, 12 giờ sáng/ 12 giờ tối trong 3 ngày. Tiếp theo quả được ủ ở cùng điều kiện nhưng độ ẩm 70 - 80%.
+ Lây bệnh không tổn thương: Các bộ phận lây bệnh được khử trùng bề mặt bằng NaOCl 1% trong 5 phút, rửa lại 2 lần bằng nước cất vô trùng, thấm khô.
Nhỏ 6 àl dịch bào tử lờn bề mặt bộ phận lõy bệnh. Ủ quả, lỏ lõy nhiễm ở 25 - 28oC, độ ẩm 100%, 12 giờ sáng/ 12 giờ tối trong 3 ngày. Tiếp theo quả được ủ ở cùng điều kiện nhưng độẩm 70 - 80%.
- Các chỉ tiêu theo dõi:
+ Thời kỳ tiềm dục: được tính bằng thời gian từ khi lây bệnh đến khi xuất hiện vết bệnh trên bộ phận lây nhiễm.
+ Tỷ lệ bệnh: được tính bằng số quả, lá xuất hiện triệu chứng bệnh/ tổng số quả, lá lây nhiễm.
+ Kích thước vết bệnh: Đo kích thước vết bệnh sau 3 ngày lây bệnh trên lá và 7 ngày với lây bệnh trên quả. Kích thước vết bệnh thu được là số liệu trung bình của các vết bệnh xuất hiện sau lây nhiễm.
3.3.3.7. Phương pháp đánh giá khả năng tồn tại của một số loài Colletotrichum trên lá ớt
Mẫu nấm sử dụng trong thí nghiệm: C4 và C30 và tương ứng với loài nấm đã được định danh là C. siamense và C. truncatum.
Giống ớt sử dụng lây bệnh là giống ớt lai Demon. Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Ranathunge et al. (2016).
Gieo hạt ớt vào các chậu nhựa, đặt trong lồng cách ly. Khi cây được 4 tuần tuổi tiến hành lây bệnh trên lá bằng phương pháp lây bệnh có tổn thương.
Phương pháp lây bệnh được thực hiện như thí nghiệm xác định tính gây bệnh nhân tạo của các mẫu nấm Colletotrichum. Mỗi loài nấm Colletotrichum được lây trên 5 cây, mỗi cây lây 5 lá để theo dõi, đánh giá.
Phương pháp đánh giá sự tồn tại của bào tử nấm: Sau khi lây bệnh, thu mẫu lá định kỳ hàng tuần và xử lý để tiến hành quan sát sự tồn tại của các loài nấm trên lá.
Quá trình xử lý được thực hiện bằng cách ngắt các lá từ cây đã được lây bệnh, cắt các miếng khoảng 1 cm2 tại vị trí lây bệnh và cho vào dung dịch ethanol nguyên chất: axit acetic với tỉ lệ 1:2 trong 24 giờ để loại bỏ diệp lục, sau đó thay thế dung dịch với thành phần tương tự và tiếp tục ngâm trong 24 giờ. Sau khi các mô được làm sạch tiến hành rửa bằng nước cất, để khô, sau đó nhuộm bằng dung dịch Trypan blue, đặt trên lam kính và nhỏ 1 giọt nước để quan sát bằng kính hiển vi.
- Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bào tử hình thành giác bám tại các vị trí lây bệnh nhân tạo. Sử dụng kính hiển vi quan sát sốlượng bào tử nảy mầm. Mỗi tuần, tiến hành quan sát 3 lá, mỗi vị trí lây bệnh/ lá quan sát 3 quang trường. Tỷ lệ bào tử hình thành giác bám là số liệu trung bình của các lần quan sát.