LU(units/mg) = 1 X 109 ED50
IU(units/mg) G-CSF kiểm tra = LU(units/mg) G-CSF kiểm tra x 108 LU(units/mg) G-CSF chuẩn
Trang 36
Vật liệu và Phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học
2.2.2.1. Khảo sát các điều kiện gây suy giảm miễn dịch chuột bằng thuốc cyclophosphamide (CPA) [14]
CPA là loại thuốc thuộc nhóm alkyl hóa, có khả năng ngăn cản sự phân chia và biệt hóa tế bào. Do đó, các loại tế bào đang phân chia trong tủy xương rất nhạy cảm với loại thuốc này. Khảo sát tác động của CPA lên sức sống và số lượng bạch
cầu tổng của chuột nhắt trắng Mus musculus var Albino ở các nồng độ và các chế độ
tiêm thuốc khác nhau là cơ sở để tạo ra mô hình chuột suy giảm miễn dịch dùng làm
đối tượng cho thử nghiệm sinh học G-CSF in vivo. Thí nghiệm dựa trên chỉ tiêu
đánh giá là sự thay đổi số lượng bạch cầu tổng sau khi tiêm thuốc so với lô đối chứng.
Chuột được nuôi ổn định trong vòng 72 giờ tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học phân tử A, Đại học Khoa học Tự nhiên. Sau đó tiến hành tiêm thuốc suy giảm miễn dịch cho chuột, đồng thời lô đối chứng được tiêm dung dịch nước muối sinh lý với cùng phương pháp, chế độ tiêm và chế độ nuôi nhốt như các lô thí nghiệm.
Khảo sát liều tiêm thuốc suy giảm miễn dịch
Tiến hành 4 lô chuột thí nghiệm:
- Lô 1: sử dụng làm lô đối chứng, tiêm bằng dung dịch nước muối sinh lý.
- Lô 2: tiêm CPA ở liều tiêm 100mg/kg
- Lô 3: tiêm CPA ở liều tiêm 200mg/kg
- Lô 4: tiêm CPA ở liều tiêm 300mg/kg
Sau đó, khảo sát số lượng bạch cầu tổng ở các thời điểm từ ngày 1 – ngày 10 sau khi tiêm thuốc suy giảm miễn dịch. Tiến hành sử dụng phương pháp kiểm định t-test nhằm so sánh hiệu quả gây suy giảm miễn dịch giữa các nồng độ CPA.
Khảo sát chế độ tiêm thuốc gây suy giảm miễn dịch tối ưu
Chúng tôi tiến hành khảo sát 3 chế độ tiêm khác nhau là: tiêm một lần, tiêm liên tục và tiêm không liên tục, sao cho tổng liều CPA được tiêm vào là liều gây suy giảm miễn dịch tốt nhất.
Trang 37
Vật liệu và Phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Hình 2.3. Quy trình tiêm thuốc và khảo sát số lượng bạch cầu ở chế độ tiêm một lần.
Các con chuột ở lô thí nghiệm được tiêm CPA một lần. Tiến hành song song với lô đối chứng được tiêm bằng dung dịch nước muối sinh lý.
b. Tiêm liên tục
Hình 2.4. Quy trình tiêm thuốc và khảo sát số lượng bạch cầu ở chế độ tiêm liên tục.
Các con chuột ở lô thí nghiệm được tiêm CPA liên tục trong 4 ngày. Tiến hành song song với lô đối chứng được tiêm liên tục trong 4 ngày bằng dung dịch nước muối sinh lý.
c. Tiêm không liên tục
Hình 2.5. Quy trình tiêm thuốc và khảo sát số lượng bạch cầu ở chế độ tiêm không liên tục.
Trang 38
Vật liệu và Phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Các con chuột ở lô thí nghiệm được tiêm không liên tục vào ngày 1 và ngày 3. Tiến hành song song lô đối chứng với cách tiêm tương tự vào ngày 1 và ngày 3 bằng dung dịch nước muối sinh lý.
Sau đó, khảo sát số lượng bạch cầu tổng ở các thời điểm từ ngày 1 – ngày 10 sau khi tiêm thuốc suy giảm miễn dịch. Tiến hành sử dụng phương pháp kiểm định t-test nhằm so sánh hiệu quả giữa các chế độ tiêm CPA.
2.2.2.2. Khảo sát nồng độ G-CSF dùng cho thử nghiệm hoạt tính in vivo
Chúng tôi chia chuột thành 4 lô thí nghiệm:
Gây suy giảm miễn dịch bằng CPA trên 4 lô chuột thí nghiệm với các điều kiện đã khảo sát.
Sau 24 giờ tiêm, chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ G-CSF tối ưu để kích thích tăng sinh bạch cầu bằng cách sử dụng G-CSF thương mại là Leukocim.
- Lô 1: lô đối chứng và được tiêm bằng dung dịch nước muối sinh lý.
- Lô 2: tiêm Leukocim ở nồng độ 1µg/kg.
- Lô 3: tiêm Leukocim ở nồng độ 5µg/kg.
- Lô 4: tiêm Leukocim ở nồng độ 10µg/kg.
Tiến hành lấy máu chuột sau 4 giờ, 8 giờ, 12 giờ, 16 giờ, 20 giờ và 24 giờ sau khi tiêm Leukocim nhằm xem xét sự tăng sinh trở lại của số lượng bạch cầu trung tính bằng phương pháp nhuộm Giemsa. Từ đó, suy ra được nồng độ tiêm thuốc có tác dụng làm tăng số lượng bạch cầu nhiều nhất.
2.2.2.3. Đề xuất quy trình xác định hoạt tính G-CSF in vivo
Tiến hành 3 lô thí nghiệm với mô hình chuột đã gây suy giảm miễn dịch bằng CPA:
- Lô 1: đối chứng âm, được tiêm bằng dung dịch nước muối sinh lý.
- Lô 2: đối chứng dương được tiêm Leukocim với nồng độ đã khảo sát
- Lô 3: mẫu thử nghiệm được tiêm cùng nồng độ với đối chứng dương. Tiến hành thu máu chuột ở các lô thí nghiệm ở 4 giờ, 8 giờ, 12 giờ, 16 giờ, 20 giờ và 24 giờ sau khi tiêm nhằm xem xét sự tăng sinh trở lại của số lượng bạch cầu. Từ đó đánh giá được hoạt tính mẫu G-CSF của Phòng thí nghiệm sản xuất.
Trang 39
Vật liệu và Phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Khảo sát tác động của G-CSF theo phác đồ điều trị [14]
Để có thể chữa trị các bệnh như Neutropenia và các bệnh liên quan đến suy giảm bạch cầu trung tính, phác đồ điều trị thường được các bác sĩ sử dụng trên bệnh nhân là tiêm liên tục G-CSF trong 4 ngày. Vì vậy, trong thí nghiệm này, chúng tôi thử nghiệm tiêm thuốc trong 4 ngày để xem xét tác động và hiệu quả chữa trị của thuốc.
Chúng tôi tiến hành 4 lô thí nghiệm:
- Lô 1: đối chứng âm được tiêm bằng dung dịch nước muối sinh lý trong 4 ngày.
- Lô 2: đối chứng dương được tiêm Leukocim với nồng độ đã khảo sát trong 4 ngày.
- Lô 3: mẫu thử nghiệm được tiêm cùng nồng độ với đối chứng dương trong 4 ngày.
Lấy máu ở đuôi sau 1 - 8 ngày để theo dõi quá trình suy giảm miễn dịch cũng như quá trình phục hồi lượng bạch cầu trung tính sau khi tiêm thuốc bằng phương pháp nhuộm Giemsa.
CHƯƠNG III
Trang 41
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
3.1. Xây dựng quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vitro
3.1.1. Quan sát hình thái và mật độ tế bào M-NFS-60 dưới tác động của G- CSF
Hiện nay, dòng tế bào M-NFS-60 đang được sử dụng phổ biến trong thử nghiệm sinh học đánh giá hoạt tính G-CSF do có khả năng tăng sinh với sự hiện diện của cytokine này. Vì thế, trạng thái và mật độ tế bào là chỉ tiêu cảm quan đầu tiên cho thấy hoạt tính protein. Để xác định khả năng kích thích tăng sinh tế bào của mẫu thử nghiệm trong chỉ tiêu đánh giá cảm quan đầu tiên này, chúng tôi xác lập thí nghiệm với sự so sánh về hình thái tế bào trên môi trường có bổ sung G-CSF
thương mại là Leukocim (đối chứng dương- hình 3.1.A) và hình thái tế bào trên môi trường không bổ sung G-CSF (đối chứng âm – hình 3.1.B). Mẫu thử nghiệm
được đánh giá là có khả năng kích thích tăng sinh tế bào khi và chỉ khi cho kết quả về hình thái tế bào tương đương như mẫu chứng dương. Các mẫu này sẽ tiếp tục được khảo sát đánh giá hoạt tính trong các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.1. Tác động kích thích tăng sinh dòng tế bào M-NFS-60 của các mẫu
Trang 42
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
3.1.1. Khảo sát mối tuơng quan giữa khả năng tăng trưởng tế bào và nồng độ G-CSF
Phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro dựa trên nguyên tắc khảo sát mối
tương quan giữa khả năng tăng trưởng tế bào dưới tác dụng của G-CSF ở các nồng độ khác nhau. Do đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nhằm xây dựng dạng đường cong chuẩn thể hiện mối tương quan này, từ đó xác định dãy nồng độ mẫu G-CSF để tiến hành thử nghiệm sinh học. Chúng tôi chọn Leukocim là một loại G-CSF thương mại để tiến hành khảo sát xây dựng quy trình với nồng độ được khảo sát từ 10-4-108pg/ml, mật độ tế bào ban đầu là 105tế bào/ml, được ủ trong thời gian 48 giờ. Chứng âm được chọn là mẫu tế bào nuôi cấy trong môi trường RPMI không bổ sung G-CSF.
Để chọn được dãy nồng độ G-CSF thích hợp cho thử nghiệm sinh học, chúng tôi tiến hành đo mật độ tế bào ở mỗi nồng độ G-CSF bằng thuốc thử CCK-8 và sử dụng phần mềm GraphPad Prism 5.0 để phân tích kết quả nhằm xây dựng đường cong tương quan giữa mật độ tế bào và nồng độ G-CSF.
Trang 43
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
-4 -2 0 2 4 6 8 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Log[G-CSF] ( OD 450 - O D 5 95 )
Hình 3.3. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa khả năng tăng trưởng tế bào và nồng độ G-CSF
Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa khả năng tăng trưởng tế bào và nồng độ G-CSF có hình sin dạng dốc lên đặc trưng của một thử nghiệm tăng sinh. Dựa vào
đồ thị (Hình 3.3), chúng tôi nhận thấy ở nồng độ 100 tế bào bắt đầu tăng trưởng (OD450 - OD595 = 0,17) và đạt đến pha ổn định ở nồng độ 104 (OD450 - OD595 = 1,42). Quá trình thử nghiệm sinh học tốt và ổn định khi biên độ thử nghiệm bao gồm 2-3 giá trị nồng độ ứng với mức tăng trưởng tế bào thấp nhất và 2-3 giá trị nồng độ ứng với mức tăng trưởng tế bào cao nhất. Như vậy, chúng tôi chọn dãy nồng độ G-CSF từ 10-2-106pg/ml để tiến hành quy trình thử nghiệm sinh học.
3.1.2. Khảo sát mật độ tế bào tiến hành thử nghiệm sinh học
Mục tiêu của thí nghiệm nhằm xác định mật độ tế bào phù hợp cho thử nghiệm sinh học. Đây là một thông số quan trọng của quy trình vì mật độ tế bào có ảnh hưởng lớn đến sự tăng sinh và phát triển của tế bào trong quần thể. Ở mật độ quá thấp, tế bào thiếu sự tương tác với nhau nên phát triển kém và đáp ứng không nhạy với G-CSF. Ngược lại, ở mật độ quá cao, tế bào nhanh chóng đạt ngưỡng bão hòa trong thời gian ngắn và đi vào apoptosis. Mật độ tế bào thích hợp khi tại đó mức độ phát triển của tế bào là tốt nhất và đáp ứng nhạy với G-CSF. Tế bào M- NFS-60 phát triển tốt trong khoảng mật độ ban đầu từ 104tế bào/ml đến 5.105tế bào/ml. Do đó, để xác định mật độ tế bào ban đầu khi tiến hành thử nghiệm sinh
Trang 44
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
học, chúng tôi khảo sát 3 giá trị là 5.104, 105, và 5.105tế bào/ml. Kết quả được đánh giá thông qua giá trị Hill slope và biên độ dao động của đường cong.
-4 -2 0 2 4 6 8 0.5 1.0 1.5 5.105tb/ml 105tb/ml 5.104tb/ml Log[G-CSF] ( OD 450 - OD 5 95 )
Hình 3.4. Đồ thị thể hiện sự tăng trưởng của dòng tế bào M-NFS-60 tương ứng dãy nồng độ G-CSF với mật độ tế bào ban đầu là 5.104, 105, và 5.105tế bào/ml
Bảng 3.1. Giá trị Hill slope và biên độ dao động của các mẫu
Nhận thấy ở cả 3 trường hợp, đồ thị đều có hình sin dạng dốc lên, tế bào tăng trưởng trong khoảng nồng độ G-CSF từ 100 - 104pg/ml.
G-CSF có vai trò kích thích tăng sinh dòng tế bào MNFS-60, do đó thử nghiệm sinh học G-CSF là một thử nghiệm tăng sinh có giá trị Hill slope chuẩn là 1. Đường cong tăng trưởng tế bào có giá trị Hill slope càng gần 1, chứng tỏ dạng tác động sinh học của mẫu kiểm tra lên tế bào càng giống với đáp ứng chuẩn. Nhận thấy, đường cong tăng trưởng ứng với mật độ tế bào ban đầu là 105tế bào/ml có giá Mật độ (tế bào/ml) Gía trị Hill slope Biên độ dao động
5.104 0,64 0,57
105 1,10 0,89
Trang 45
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
trị Hill slope gần với 1 nhất (1,10) trong khi ở mật độ 5.104 và 5.105tế bào/ml, giá
trị Hill slope khá xa 1 (0,64 và 7,00) (Bảng 3.1).
Bên cạnh đó, độ nhạy của thử nghiệm cũng là một tiêu chí quan trọng khi khảo sát xây dựng quy trình. Tiêu chí này được biểu thị qua biên độ dao động, tức là khoảng cách giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của đường cong. Giá trị này càng lớn, nghĩa là khoảng dao động càng rộng thì độ nhạy của thử nghiệm càng cao, kết quả càng có độ chính xác.
- Dựa vào đồ thị và kết quả phân tích, chúng tôi nhận thấy với mật độ ban đầu đưa vào là 5.104tế bào/ml, tế bào có sự tăng trưởng biểu hiện ở giá trị OD450 - OD595 tăng từ 0,25 đến 0,79 và biên độ dao động là 0,57. Tuy nhiên, giá trị này khá thấp chứng tỏ mức độ tăng trưởng tế bào chưa cao và biên độ dao động khá nhỏ phản ánh kết quả thử nghiệm sinh học có độ nhạy thấp.
- Với mật độ ban đầu là 5.105tế bào/ml, biên độ dao động là thấp nhất (0,29). Điều này có thể giải thích là do mật độ tế bào ban đầu đưa vào quá cao, tế bào nhanh chóng đạt ngưỡng phát triển tối đa và đi vào quá trình apoptosis, số lượng tế bào giảm ở thời điểm kết thúc quy trình.
- Với mật độ ban đầu là 105tế bào/ml, giá trị OD450 - OD595 cao đồng thời biên độ dao động là lớn nhất (0,89) chứng tỏ tế bào tăng trưởng mạnh và đáp ứng nhạy với G-CSF.
Từ các kết quả trên, chúng tôi chọn mật độ tế bào ban đầu là 105tế bào/ml cho kết quả tăng trưởng tốt và nhạy với nồng độ G-CSF để tiến hành thử nghiệm sinh học.
3.1.3. Khảo sát thời gian tiến hành thử nghiệm sinh học
Trong nuôi cấy tế bào cũng như thử nghiệm hoạt tính, thời gian ủ có vai trò quan trọng. Dựa vào khoảng thời gian phù hợp cho sự tăng trưởng của dòng tế bào MNFS-60 (theo ATCC), chúng tôi tiến hành khảo sát 3 khoảng thời gian ủ là 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ để chọn ra thời điểm kết thúc quá trình thử nghiệm. Kết quả được đánh giá dựa trên giá trị Hill slope và biên độ dao động của đường cong.
Trang 46
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
-4 -2 0 2 4 6 8 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 24h 48h 72h Log[G-CSF] ( OD 4 50 - OD 5 95 )
Hình 3.5. Đồ thị thể hiện tác động của thời gian tiến hành thử nghiệm sinh học lên dòng tế bào M-NFS-60
Bảng 3.2. Giá trị Hill slope và biên độ dao động của các mẫu
Dựa vào kết quả phân tích, chúng tôi nhận thấy giá trị Hill slope của đường cong tăng trưởng ứng với thời gian tiến hành 48 giờ là 0,97. Giá trị này gần nhất với giá trị chuẩn là 1. Trong khi đó 2 trường hợp còn lại cho kết quả giá trị Hill slope cách xa giá trị chuẩn (0,75 và 1,57). Điều này cho thấy khoảng thời gian 48 giờ là phù hợp nhất để tế bào tăng trưởng dưới tác động của G-CSF.
Tiến hành so sánh biên độ dao động của các đường cong tăng trưởng để đánh giá độ nhạy của thử nghiệm, chúng tôi nhận thấy khi tiến hành quy trình trong 24 giờ, số lượng tế bào tăng sinh ít thể hiện ở kết quả OD450 - OD595 thấp và biên độ dao động nhỏ (0,19) nên không nhận thấy rõ tác động của G-CSF ở các nồng độ