2.2.1.1. Khảo sát mối tương quan giữa khả năng tăng trưởng tế bào và nồng độ G-CSF
Trong khoảng mật độ và thời gian ủ thích hợp, tế bào M-NFS-60 sẽ tăng sinh mạnh, duy trì trạng thái tế bào tốt. Khảo sát mối tương quan giữa khả năng tăng trưởng tế bào và nồng độ G-CSF nhằm xây dựng đường cong tăng trưởng và chọn dãy nồng độ G-CSF thích hợp tiến hành thử nghiệm sinh học.
Bước 1: Chuẩn bị tế bào M-NFS-60
- Dịch nuôi cấy tế bào M-NFS-60 ở trạng thái đang tăng sinh biểu hiện ở mật độ tế bào dày, có ít hoặc không có tế bào chết, hình thái tế bào to, tròn, khúc xạ ánh sáng.
- Ly tâm 1300rpm, trong 5-7 phút. - Thu sinh khối tế bào.
- Rửa tế bào bằng môi trường RPMI 1640 không bổ sung M-CSF trong 3 lần.
- Bổ sung 3ml môi trường RPMI 1640.
- Đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu sau khi nhuộm Trypan Blue 0.22%.
- Bổ sung môi trường RPMI 1640 để mật độ tế bào đạt 2.105tế bào/ml. Bước 2: Chuẩn bị mẫu G-CSF
- Mẫu G-CSF thương mại (Leukocim) được bảo quản trong PBS ở 40C. - Pha loãng mẫu G-CSF thành dãy nồng độ từ 108 đến 10-4pg/ml.
- Chuyển mẫu G-CSF vào đĩa 96 giếng với thể tích 50µl mẫu G- CSF/giếng.
Trang 32
Vật liệu và Phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Bước 3: Khảo sát mối tương quan giữa khả năng tăng trưởng tế bào và nồng độ G-CSF
- Ủ đĩa trong tủ ấm 370C, 5% CO2, và độ ẩm 85% trong 48 giờ. - Bổ sung 10µl CCK-8 vào mỗi giếng.
- Ủ ở 370C trong 3 giờ.
- Đọc kết quả đo mật độ quang ở bước sóng 450nm và 595nm bằng máy Multiskan Ascent.
- Kết quả được phân tích bằng phần mềm GraphPad Prism 5.0 và vẽ đồ thị thể hiện mối tương quan giữa khả năng tăng trưởng tế bào với nồng độ G- CSF.
- Từ giá trị ED50 tính được bằng phần mềm GraphPad Prism 5.0, suy ra các giá trị LU, IU của mẫu G-CSF theo công thức: [20]
2.2.1.2. Khảo sát mật độ tế bào tiến hành thử nghiệm sinh học
Các tế bào trong môi trường vừa có mối quan hệ tương hỗ, vừa cạnh tranh với nhau về chất dinh dưỡng, không gian sống. Mật độ tế bào là tác nhân ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự tồn tại và tốc độ tăng trưởng của tế bào trong quần thể. Trong quá trình tăng trưởng, mật độ tế bào duy trì mối quan hệ qua lại giữa các tế bào. Mối quan hệ này bao gồm việc sử dụng chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy và tạo ra chất thải có khả năng ức chế các tế bào khác. Mật độ thấp ức chế hoặc làm chậm nhịp độ các tế bào bước vào giai đoạn tăng trưởng. Ngược lại, mật độ ban đầu
LU(units/mg) = 1 X 109 ED50
(pg/ml)
LU(units/mg) G-CSF chuẩn : IU(units/mg) G-CSF chuẩn (108) LU(units/mg) G-CSF kiểm tra : IU(units/mg) G-CSF kiểm tra
IU(units/mg) G-CSF kiểm tra = LU(units/mg) G-CSF kiểm tra x 108 LU(units/mg) G-CSF chuẩn (pg/ml)
Trang 33
Vật liệu và Phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học
quá cao có thể làm tế bào ngừng tăng sinh và dẫn đến apoptosis, đặc biệt các tế bào nuôi cấy huyền phù như myeloma và hybridoma. Do đó tham số mật độ tế bào cần được khảo sát đầu tiên trong thử nghiệm sinh học.
Mật độ nuôi cấy tế bào lý tưởng phụ thuộc vào từng loại tế bào. Phần lớn tế bào phát triển tốt trong khoảng mật độ 104-106 tế bào/ml. Ở mật độ thấp (104tế bào/ml) tế bào phát triển nhanh, sử dụng hiệu quả môi trường. Ở mật độ cao (106tế bào/ml) mật độ tế bào đạt ngưỡng bão hòa trong thời gian ngắn và nhanh chóng đi vào apoptosis [21]. Như vậy, khi thực hiện thử nghiệm sinh học cần phải lựa chọn giá trị mật độ tế bào ban đầu đưa vào sao cho tế bào phát triển tốt nhất và sử dụng hiệu quả G-CSF để tăng trưởng.
Mật độ ban đầu
Môi trường thay đổi
Cấy chuyền
Thời gian (Ngày)
Tế bào / m l Mật độ ban đầu Môi trường thay đổi Cấy chuyền
Thời gian (Ngày)
Tế bào / m l T ế bào / ml
Thời gian (Ngày)
Mật độ bão hòa T ế bào / cm 2 T ế bào / ml
Thời gian (Ngày)
Mật độ bão hòa T ế bào / cm 2 T ế bào / ml
Thời gian (Ngày)
Mật độ bão hòa T ế bào / cm 2
Hình 2.2. Đường cong tăng trưởng tế bào trong nuôi cấy in vitro. (a) Phần lớn tế bào phát triển nhanh ở mật độ 104 tế bào/ml và đạt mật độ cao nhất khoảng 106 tế
bào/ml. (b) Các tham số động học từ đường cong tăng trưởng [21].
Tế bào M-NFS-60 có mật độ phát triển tốt trong khoảng 104tế bào/ml đến 5.105 tế bào/ml. Do đó, để khảo sát mật độ tế bào ban đầu khi tiến hành thử nghiệm sinh học, ta sử dụng 3 giá trị khảo sát là 5.104, 105, và 5.105tế bào/ml.
Quy trình khảo sát thông số mật độ tế bào được tiến hành như sau:
- Cố định các thông số của quy trình chung và khảo sát thông số mật độ tế bào ở các giá trị là 5.104tế bào/ml, 105tế bào/ml, và 5.105tế bào/ml.
- Kết quả phân tích bằng phần mềm GraphPad Prism 5.0 và vẽ đồ thị nhằm khảo sát mật độ tế bào tối ưu để thực hiện thử nghiệm sinh học.
Trang 34
Vật liệu và Phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học
2.2.1.3. Khảo sát thời gian tiến hành thử nghiệm sinh học
Thời gian ủ là một nhân tố giới hạn đối với thí nghiệm thử nghiệm sinh học. Thời gian ủ ngắn, tế bào chưa có sự tăng trưởng đáng kể, do đó không thể đánh giá được tác động của G-CSF đối với tế bào. Thời gian ủ quá dài có thể gây hiện tượng thiếu chất dinh dưỡng hay tăng tính acid trong môi trường dẫn đến sự giảm mạnh mật độ tế bào. Do đó, khi thực hiện thử nghiệm sinh học nên kết thúc vào thời điểm mật độ tế bào đạt cao nhất trong giới hạn của chúng. Ở thời điểm đó, tác động của G-CSF đối với tế bào thể hiện rõ ràng và hoạt tính G-CSF được xác định một cách chính xác nhất.
Để khảo sát thời gian tiến hành thử nghiệm sinh học tối ưu, ta sử dụng 3 giá trị khảo sát là 24 giờ, 48 giờ, và 72 giờ. Đây là khoảng thời gian nuôi cấy được cho là phù hợp đối với sự tăng trưởng tối đa của dòng tế bào M-NFS-60 (theo ATCC).
Quy trình khảo sát thông số thời gian thử nghiệm được tiến hành như sau: - Cố định các thông số của quy trình chung và khảo sát thông số thời gian tiến hành thử nghiệm sinh học lần lượt trong 24 giờ, 48 giờ, và 72 giờ.
- Kết quả phân tích bằng phần mềm GraphPad Prism 5.0 và vẽ đồ thị nhằm khảo sát thời gian ủ tối ưu để thực hiện thử nghiệm sinh học.
- Kết quả thời gian ủ tối ưu được áp dụng cho các thí nghiệm sau. 2.2.1.4. Đề xuất quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF in vitro
Quy trình định tính mẫu G-CSF
- Mẫu G-CSF chuẩn bị cho quy trình định tính bao gồm: Chứng (+) là mẫu G-CSF chuẩn (Leukocim)
Chứng (-) là môi trường RPMI 1640 và buffer hòa tan mẫu Mẫu G-CSF cần định tính
Các mẫu G-CSF được bảo quản trong PBS ở 40C. - Pha loãng các mẫu này đạt nồng độ 2.102pg/ml.
- Chuyển các mẫu vào đĩa 96 giếng với thể tích 50µl mẫu/giếng. - Bổ sung 50µl dịch tế bào đã xử lý vào mỗi giếng.
Trang 35
Vật liệu và Phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học
- Quan sát dưới kính hiển vi soi ngược đánh giá các tiêu chí về hình thái và mật độ tế bào nhằm định tính mẫu G-CSF cần kiểm tra.
- Bổ sung 10µl CCK-8 vào mỗi giếng. - Ủ ở 370C trong 3 giờ.
- Đo mật độ quang ở bước sóng 450nm và 595nm bằng máy Multiskan Ascent. - Phân tích tác động của các mẫu lên sự tăng sinh tế bào.
Quy trình định lượng mẫu G-CSF
- Mẫu G-CSF được chuẩn bị cho quy trình định lượng bao gồm: Mẫu G-CSF chuẩn (Leukocim)
Mẫu G-CSF cần định lượng
- Các mẫu G-CSF được bảo quản trong PBS ở 40C.
- Các mẫu G-CSF được pha loãng thành dãy nồng độ từ 106 đến 10-2pg/ml. - Bổ sung 50µl mẫu G-CSF và 50µl dịch tế bào vào đĩa 96 giếng.
- Ủ đĩa trong tủ ấm 370C, CO2 5% trong 48 giờ.
- Bổ sung cell counting kit tỉ lệ 1/10 (v/v), ủ trong 3 giờ.
- Đo mật độ quang ở bước sóng 450nm và 595nm bằng máy Multiskan Ascent. - Kết quả được phân tích bằng phần mềm GraphPad Prism 5.0
- Vẽ đường cong tương quan giữa nồng độ mẫu và mật độ tế bào ứng với mẫu G- CSF chuẩn và mẫu cần định lượng nhằm xác định hoạt tính sinh học của mẫu G- CSF. Dựa trên đồ thị và giá trị ED50, ta tính được giá trị LU của mỗi mẫu theo công thức [20]
Từ giá trị LU, ta suy ra được giá trị IU của các mẫu.