Mục đích của việc xác định hoạt tính các mẫu protein trước tinh chế nhằm xem xét tác động của các tạp chất đến hiệu quả quá trình thử nghiệm sinh học, xác định hoạt tính mẫu đồng thời so sánh với hoạt tính của mẫu protein sau tinh chế, từ đó đánh giá hiệu quả quá trình tinh chế.
Chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính sinh học 2 loại mẫu:
Mẫu D, E : Sản xuất theo quy trình tái gấp cuộn thể vùi cổ điển còn lẫn các tạp chất như ure, sucrose...
Mẫu F: Sản xuất theo quy trình hòa tan thể vùi non-classical còn lẫn N-lauroyl sarcosine.
Để có cơ sở cho việc định lượng hoạt tính protein, chúng tôi tiến hành quy trình định tính trước với các mẫu D, E, F được pha loãng đến nồng độ 102pg/ml. Để chứng minh hoạt tính của mẫu, chúng tôi sử dụng 2 mẫu đối chứng (-) là môi trường RPMI 1640 và buffer hòa tan, mẫu đối chứng (+) là G-CSF thương mại (Leukocim). Hoạt tính mẫu được đánh giá dựa trên hình thái tế bào quan sát dưới kính hiển vi soi ngược và kết quả đo mật độ quang.
Trang 54
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Hình 3.8. Tác động của các mẫu G-CSF đến hình thái và mật độ tế bào
A: Mẫu đối chứng âm - môi trường RPMI; B: Mẫu đối chứng âm - buffer; C: Mẫu đối chứng dương - Leukocim; D, E, F: Mẫu G-CSF cần kiểm tra
Quan sát mật độ và hình thái tế bào dưới tác động của mẫu đối chứng (+) (Leukocim), chúng tôi nhận thấy mật độ tế bào dày, tế bào phát triển và đang phân chia, trạng thái tốt, không có hoặc rất ít tế bào chết. Kết quả quan sát tương tự ở các mẫu G-CSF cần kiểm tra E và F chứng minh 2 mẫu E, F có hoạt tính. Ngược lại, ở các mẫu đối chứng âm và mẫu G-CSF kiểm tra D, mật độ tế bào thưa, tế bào chết nhiều, kích thước tế bào nhỏ.
Mẫu D được tiếp tục kiểm tra hoạt tính ở nồng độ 103pg/ml và 104pg/ml. Kết quả quan sát hình thái tế bào được thể hiện như sau
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra mẫu D
A. Nồng độ mẫu thử là 103pg/ml B. Nồng độ mẫu thử là 104pg/ml
Trang 55
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Từ các kết quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy mẫu D với các nồng độ tăng cao cũng không có tác dụng kích thích tăng sinh tế bào, chứng tỏ mẫu D không có hoạt tính.
Để khẳng định kết quả quan sát, chúng tôi tiến hành xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 450nm và 595nm. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.4 và hình 3.10.
Bảng 3.4. Kết quả đo OD450 –OD595 các mẫu thử nghiệm
Hình 3.10. Kết quả định tính mẫu G-CSF
Dựa vào biểu đồ, chúng tôi nhận thấy ở mẫu Leukocim, E, F, kết quả mật độ quang cao (lần lượt là 0,71; 0,65; 0,52) chứng tỏ có sự tăng sinh tế bào dưới tác
Mẫu ∆(OD450-OD595)
Đối chứng âm (RPMI) Đối chứng âm (Buffer) Đối chứng dương (Leukocim)
Mẫu D Mẫu E Mẫu F 0,15±0,007 0,23±0,005 0,71±0,006 0,18±0,003 0,65±0,007 0,52±0,005
Trang 56
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
dụng của mẫu thử. Trong khi đó, ở mẫu RPMI, buffer hòa tan và mẫu D kết quả mật độ quang thấp (lần lượt là 0,15; 0,23; 0,18) thể hiện tế bào không hoặc ít tăng sinh. Kết quả này phù hợp với quan sát hình thái tế bào. Như vậy, mẫu protein E và F có hoạt tính còn mẫu D không có hoạt tính.
Hai mẫu E, F sau khi được chứng minh là có hoạt tính sẽ tiếp tục được định lượng theo quy trình đã xác lập. Sử dụng phần mềm GraphPad Prism 5.0 để phân tích kết quả đo mật độ quang, chúng tôi xây dựng đường cong tương quan giữa logarit nồng độ mẫu thử và mức độ tăng trưởng tế bào, từ đó xác định giá trị ED50 của mẫu. -4 -2 0 2 4 6 8 0.5 1.0 1.5 Leukocim E F Log[G-CSF] ( OD 4 50 - OD 5 95 )
Hình 3.11. Đường cong tương quan giữa mức độ tăng sinh tế bào và nồng độ mẫu G-CSF
Kết quả đường cong tương quan giữa mức độ tăng sinh tế bào và nồng độ mẫu trước tinh chế có dạng hình sin dốc lên, không có biểu hiện bất thường trong quá trình tăng trưởng tế bào chứng tỏ các tạp chất trong mẫu protein trước tinh chế không ảnh hưởng đáng kể đến kết quả thử nghiệm sinh học. Dựa vào đồ thị, chúng tôi nhận thấy đoạn tuyến tính của 2 đường cong gần như song song, do đó mẫu kiểm tra và mẫu chuẩn có cùng dạng tác động tăng sinh lên tế bào M-NFS-60 nên
Trang 57
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Bảng 3.5. Kết quả tính LU và IU mẫu G-CSF chuẩn và mẫu trước tinh chế
G-CSF chuẩn Mẫu E Mẫu F ED50(pg/ml) 115,6 386,2 534,9 LU(units/mg) 8,65.106 2,60.106 1,87.106
IU(units/mg) 108 0,30.108 0,22.108
Như vậy, quy trình có thể được áp dụng để xác định hoạt tính các mẫu protein trước tinh chế.