Cyclophosphamide (CPA)
CPA là loại thuốc thuộc nhóm alkyl hóa, có khả năng ngăn cản sự phân chia và biệt hóa tế bào. Do đó, các loại tế bào đang phân chia trong tủy xương rất nhạy cảm với loại thuốc này. Khảo sát tác động của CPA lên sức sống và lượng bạch cầu
tổng của chuột nhắt trắng Mus musculus var Albino ở các liều thuốc và các chế độ
tiêm thuốc khác nhau là cơ sở để tạo ra mô hình chuột suy giảm miễn dịch áp dụng cho các nội dung thí nghiệm tiếp theo. Thí nghiệm dựa trên chỉ tiêu đánh giá là sự thay đổi số lượng bạch cầu sau khi tiêm thuốc so với lô đối chứng.
3.3.1.1. Khảo sát nồng độ CPA
Nồng độ CPA là một yếu tố quan trọng để tạo nên mô hình chuột suy giảm
miễn dịch dùng trong thử nghiệm in vivo. Nồng độ quá cao sẽ ảnh hưởng đến trạng
thái sinh lý của chuột, không đảm bảo số lượng cũng như trạng thái chuột cho bước thử nghiệm về sau. Ngược lại, nồng độ quá thấp sẽ không gây suy giảm miễn dịch hiệu quả, chuột nhanh chóng tự phục hồi trạng thái ban đầu, dẫn đến việc khó phân
Trang 61
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
tích đánh giá tác dụng của G-CSF khi thử nghiệm. Nồng độ tiêm thuốc thích hợp là nồng độ gây suy giảm miễn dịch mạnh, nghĩa là số lượng bạch cầu trong máu phải giảm mạnh, tuy nhiên không làm chết chuột; đồng thời ở nồng độ này, độ bền của thuốc trong cơ thể là lâu nhất.
Chúng tôi tiến hành khảo sát 3 giá trị nồng độ CPA gồm 100mg/kg, 200mg/kg và 300mg/kg để tìm ra nồng độ tiêm thuốc thích hợp nhất. Nổng độ này được xác định từ việc so sánh hiệu quả gây suy giảm miễn dịch trong 10 ngày sau khi tiêm thuốc. Lô đối chứng âm được tiến hành song song bằng cách tiêm dung
dịch nước muối sinh lý. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Tương quan giữa lượng bạch cầu tổng (%) và nồng độ CPA
Ngày 0 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5
Đối chứng 100±0 94±9 107±3 99±1 90±2 111±4
Liều 100 100±0 47±3 41±2 33±4 38±8 38±8
Liều 200 100±0 25±2 25±4 18±3 22±6 23±5
Liều 300 100±0 34±4 21±8 10±2 12±2 11±6
Ngày 6 Ngày 7 Ngày 8 Ngày 9 Ngày 10 Đối chứng 104±9 101±6 95±6 100±8 106±1
Liều 100 37±2 56±8 82±4 86±6 97±15
Liều 200 24±4 50±5 59±5 63±4 79±7
Trang 62
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu tổng theo nồng độ CPA
Quan sát trạng thái chuột sau khi tiêm thuốc, chúng tôi nhận thấy trạng thái sinh lý của chuột vẫn bình thường, không có các dấu hiệu như rụng lông, mù mắt. Sau 10 ngày khảo sát không phát hiện chuột bị chết trong quá trình thí nghiệm.
Dựa vào đồ thị kết hợp với phân tích thống kê cho thấy cả 3 nồng độ CPA đều có tác dụng gây suy giảm miễn dịch ở chuột biểu thị qua lượng bạch cầu tổng giảm mạnh so với lô đối chứng, tình trạng này kéo dài trong vòng 6 ngày sau khi tiêm thuốc. Từ ngày thứ 7 trở đi, số lượng bạch cầu trong cơ thể chuột bắt đầu tăng mạnh và gần phục hồi như ban đầu. So sánh hiệu quả gây suy giảm miễn dịch giữa các liều, chúng tôi nhận thấy liều 200mg/kg và 300mg/kg có hiệu quả gây suy giảm miễn dịch là như nhau và mạnh hơn liều 100mg/kg.
Như vậy, chúng tôi chọn nông độ CPA là 200 mg/kg để gây suy giảm miễn dịch nhằm tạo ra mô hình chuột bệnh.
3.3.1.2. Khảo sát chế độ tiêm CPA
CPA là một tác nhân gây suy giảm miễn dịch nên mỗi lần tiêm vào cơ thể cần sử dụng liều lượng thấp để không ảnh hưởng mạnh đến sức sống, trạng thái sinh lý của cơ thể. Tuy nhiên, cũng cần phải đảm bảo nồng độ CPA sử dụng để đạt hiệu quả gây suy giảm miễn dịch cao. Để thực hiện mục tiêu này, chúng tôi tiến hành khảo sát chế độ tiêm CPA nhằm giảm lượng thuốc ở mỗi lần tiêm vào cơ thể chuột đồng thời vẫn đảm bảo nồng độ thuốc hiệu quả. Chế độ tiêm thích hợp phải đảm
Trang 63
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
bảo 2 tiêu chí vừa gây suy giảm miễn dịch hiệu quả vừa không có tác động xấu đến trạng thái sinh lý, sức sống của chuột. Để chọn được chế độ tiêm phù hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát ba chế độ tiêm là tiêm 1 lần, tiêm liên tục và tiêm không liên tục sao cho tổng liều thuốc sử dụng là 200mg/kg và phân tích kết quả dựa trên sự suy
giảm số lượng bạch cầu tổng. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Tương quan giữa lượng bạch cầu tổng (%) và chế độ tiêm CPA
Chế độ
tiêm Lô Ngày 0 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Một lần Đối chứng 100±0 108±2 103±7 105±1 121±9 99±7 Thí nghiệm 100±0 98±2 73±8 28±5 24±3 30±9 Liên tục Đối chứng 100±0 111±2 104±7 144±1 150±9 113±7 Thí nghiệm 100±0 84±2 43±4 23±3 21±4 7±5 Không liên tục Đối chứng 100±0 128±2 115±7 124±1 148±9 123±7 Thí nghiệm 100±0 85±4 34±1 33±4 21±4 15±4 Chế độ
tiêm Lô Ngày 6 Ngày 7 Ngày 8 Ngày 9 Ngày 10 Ngày 11 Một lần Đối chứng 108±3 106±5 110±5 116±8 110±6 103±13 Thí nghiệm 40±2 32±1 88±1 122±9 109±2 104±10 Liên tục Đối chứng 112±3 113±5 119±5 139±8 138±6 151±13 Thí nghiệm 7±3 16%±2 33±4 45±3 86±3 88±3 Không liên tục Đối chứng 139±3 134±5 116±5 128±8 129±6 133±13 Thí nghiệm 11±3 5±3 5±3 21±0 20±0 23±0
Trang 64
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu tổng theo chế độ tiêm CPA
Dựa vào đồ thị kết hợp với phân tích thống kê, chúng tôi nhận thấy cả ba chế độ tiêm đều có tác dụng gây suy giảm miễn dịch trên chuột. So với lô thí nghiệm tiêm một lần, hiệu quả gây suy giảm miễn dịch của chế độ tiêm liên tục và tiêm không liên tục mạnh hơn biểu thị qua lượng bạch cầu tổng sau khi gây suy giảm miễn dịch có thể chỉ còn khoảng 5-10% so với tình trạng ban đầu.
Tuy nhiên, về trạng thái sinh lý, ở lô thí nghiệm tiêm không liên tục 2/3 số chuột bị chết trong quá trình thí nghiệm, còn ở lô thí nghiệm tiêm liên tục, chuột có dấu hiệu bị viêm tại vị trí tiêm cũng như một số biểu hiện khác như rụng lông, cử động chậm chạp. Điều này có thể do lượng bạch cầu tổng ở mức quá thấp đã ảnh hưởng mạnh đến sức khỏe và khả năng sống sót của chuột, do đó, ảnh hưởng đến sự ổn định của mô hình chuột suy giảm miễn dịch sử dụng cho việc thử nghiệm G- CSF.
Từ kết quả trên, chúng tôi lựa chọn chế độ tiêm 1 lần với liều 200mg/kg để xây dựng mô hình chuột bệnh.