Quy trình định tính mẫu G-CSF
Quy trình định tính được xác lập dựa trên các thông số đã khảo sát, bao gồm: - Nồng độ mẫu G-CSF dùng trong quy trình định tính: nằm trong khoảng nồng độ tối ưu cho sự tăng trưởng tế bào đã được khảo sát từ mục 3.1 (10-2 - 106pg/ml). Nồng độ khởi điểm được thực hiện tương đương với giá trị ED50 trung bình của các mẫu đã khảo sát. ED50 là giá trị tại đó G-CSF kích thích sự tăng trưởng tế bào đạt 50%, đây là giá trị tiêu chuẩn nhằm đánh giá tác động sinh học của một chất lên quần thể tế bào. Từ kết quả khảo sát ở mục (1, 2, 3) đối với mẫu G-CSF thương mại là Leukocim, chúng tôi nhận thấy giá trị ED50 nằm trong khoảng nồng độ là 2.102pg/ml. Do đó, chúng tôi chọn nồng độ các mẫu G-CSF dùng trong quy trình định tính là 2.102pg/ml.
Vì thành phần mẫu protein cần định tính chưa xác định, đôi khi còn lẫn protein tạp nên có khả năng lượng G-CSF có hoạt tính trong mẫu chiếm tỷ lệ rất thấp. Do đó, đối với các mẫu cho kết quả âm tính ở nồng độ 2.102pg/ml, nếu cần xem xét ngưỡng hoạt tính tác dụng của mẫu, có thể lặp lại qui trình với nồng độ mẫu thử gấp 10 lần (2.103pg/ml, tương đương ED90) hoặc gấp 100 lần (2.104pg/ml, tương đương ED99) để xác định hoạt tính kính thích tăng sinh tế bào của mẫu thử.
- Dựa vào các kết quả đã khảo sát, chúng tôi chọn mật độ tế bào ban đầu trong quy trình định tính là 105tế bào/ml và thời gian tiến hành quy trình là 48giờ.
Trang 48
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Kết quả định tính mẫu G-CSF được đánh giá dựa trên hai tiêu chí là hình thái tế bào (quan sát dưới kính hiển vi soi ngược) và mật độ tế bào (đo OD ở bước sóng 450nm và 595nm dưới tác dụng của CCK-8).
Quy trình định tính mẫu có thể được tóm tắt như sau:
Quy trình định lượng mẫu G-CSF
Sản phẩm thuốc chứa G-CSF tái tổ hợp do phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học phân tử A (CNSHPT A) phát triển công nghệ là dạng thuốc generic – thuốc sản xuất mô phỏng theo thuốc đã được sử dụng và lưu hành rộng rãi với sự cho phép của WHO. Do vậy, theo yêu cầu của quy trình phát triển thuốc, các thuốc generic cần được chứng minh bằng các thử nghiệm tương đương sinh học. Với các lý do trên, chúng tôi xây dựng quy trình định lượng G-CSF theo nguyên tắc thử nghiệm tương đương sinh học. Các mẫu thử G-CSF sẽ được đánh giá và so sánh với mẫu chuẩn là sản phẩm G-CSF đã được cho phép sử dụng trên thị trường.
Quy trình định lượng mẫu được xây dựng dựa trên các công bố trước đó [20], [21] và các thông số đã được khảo sát ở mục (1, 2, 3).
50l tế bào đã loại M-CSF (2.105 tế bào/ml) 50l - Chứng (-) - Chứng (+) - Mẫu thử (2.102pg/ml) Giếng nuôi cấy
Ủ 37oC, CO2 5%, 48 giờ
Quan sát mật độ, hình thái tế bào
Trang 49
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
- Mẫu G-CSF được chuẩn bị cho quy trình định lượng bao gồm: Mẫu G-CSF thương mại (Leukocim)
Mẫu G-CSF cần định lượng
Kết quả đo OD450 - OD595 được phân tích bằng phần mềm GraphPad Prism 5.0 và phân tích đồ thị gồm hai đường cong biểu diễn tác động của G-CSF chuẩn và mẫu G-CSF cần kiểm tra lên sự tăng trưởng tế bào. Từ đồ thị, chúng tôi suy ra giá trị ED50 và tính được các giá trị LU và IU của mẫu G-CSF cần định lượng. Quy trình định lượng mẫu có thể tóm tắt như sau:
IU(units/mg) mẫu = LU(units/mg) mẫu x 108 LU(units/mg) G-CSF chuẩn (pg/ml) LU(units/mg) = 1 x 109 ED50 50l tế bào đã loại M-CSF (2.105 tế bào/ml) 50l - Chứng (+) - Mẫu thử (10-2-106pg/ml)
Giếng nuôi cấy
Ủ 37oC, CO2 5%, 48 giờ Quan sát mật độ, hình thái tế bào Phân tích kết quả bằng phần mềm GraphPad Prism 5.0 Xác định đơn vị hoạt tính của mẫu định lượng
Trang 50
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học