U khuyết điểm của thử nghiệm hoạt tính in vivo

1.4.4.1. Ưu điểm

Quá trình tạo máu là một quá trình xảy ra trong cơ thể động vật, chịu ảnh

hưởng của nhiều tác nhân. Do đó nếu chỉ khảo sát ở mức độ in vitro, các tác động của thuốc vẫn chưa được đánh giá hết. Sử dụng thử nghiệm in vivo trên mô hình

động vật có thể đánh giá những tác động của thuốc khi tiêm vào cơ thể bệnh nhân cũng như tương tác của thuốc với các cơ quan trong cơ thể.

Do tiến hành trên cơ thể động vật nên có thể khảo sát một số đặc tính của thuốc như thời gian lưu trong máu, thời gian bán rã của thuốc trong huyết thanh, quá trình hấp thụ thuốc ở ruột, quá trình lọc và tích tụ thuốc ở gan và thận. Từ đó tiến đến khảo sát đưa ra phác đồ điều trị hiệu quả trên các bệnh nhân khác nhau. 1.4.4.2. Khuyết điểm

Phải thực hiện trên quy mô số lượng lớn động vật thí nghiệm. Điều này gây khó khăn, tốn kém trong việc nghiên cứu trên các động vật thuộc bộ linh trưởng như khỉ và tinh tinh, cũng như một số động vật khác như chó, thỏ. Thử nghiệm trên các bệnh nhân tình nguyện đòi hỏi phải có những văn bản pháp luật và những nguy cơ tiềm ẩn khác nhau.

Mặc dù đặc điểm sinh lý ở các động vật thí nghiệm và con người có thể tương đối giống nhau, tuy nhiên mức độ giống nhau này không phải là tuyệt đối. Do đó, với hệ miễn dịch phức tạp như ở con người, dễ xảy ra các tác dụng phụ khác nhau không thể lường trước được.

CHƯƠNG II

Trang 24

Vật liệu và Phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2.1. Vật liệu

2.1.1. Dụng cụ và thiết bị

Ngoài các dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm, luận văn sử dụng các thiết bị sau:

- Bình Roux 25cm2 (NUNC) - Bình lọc chân không (NANGEN) - Buồng đếm hồng cầu (NEUBAUER) - Cryotube (NUNC)

- Đĩa nuôi tế bào (COSTAR, kích thước 35x10 mm) - Đĩa nuôi tế bào 96 giếng (NUNC)

- Giấy đo pH.

- Màng lọc vô trùng Minisart có đường kính lỗ lọc 0.20 µm (SARTORIUS) - Kính hiển vi soi ngược CKX41 (Olympus)

- Kính hiển vi - Lamelle - Kim tiêm 1ml

- Ống hút Thoma chuyên dùng pha loãng máu đếm bạch cầu - Syringe 1cc có đầu kim 26G.

2.1.2. Hóa chất

Tất cả các hóa chất sau được cung cấp bởi các hãng Amersham, Biorad, Fermentas, , Invitrogen, Merck, Sigma và Toyobo.

 Hóa chất dùng cho bảo quản mẫu

Dung dịch PBS (Phosphat Buffer Saline) 1X

Công thức pha dung dịch PBS

Thành phần Hàm lượng

NaCl 8g

Trang 25

Vật liệu và Phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học

Na2HPO4 1.44g

KH2PO4 0.24g

Nước cất vừa đủ 1000ml - Chuẩn pH đến 7.4

- Hấp vô trùng dung dịch ở 1210C, 1 atm trong 20 phút. - Bảo quản trong tủ mát ở 40C.

 Hóa chất dùng cho đông lạnh tế bào

Công thức pha môi trường đông lạnh (1000ml)

Thành phần Hàm lượng

RPMI 1640+MCSF 850 ul

FBS (20%) 100 ul

DMSO (5%) 50 ul

- Lọc DMSO với màng lọc 0.2 µm trước khi pha môi trường đông lạnh.

- Bổ sung môi trường đông lạnh sao cho mật độ tế bào trong 1 ống đạt 106 tế bào/ml.

 Hóa chất dùng cho nuôi cấy tế bào a. Dung dịch FBS (Fetal Bovine Serum)

- Dung dịch FBS sản xuất bởi GIBCOTM tại Mexico đạt tiêu chuẩn nhập khẩu của USDA.

- Dung dịch FBS đã qua các thử nghiệm kiểm tra tính chất, đảm bảo không có sự hiện diện của mycoplasma, virút, và nội độc tố.

- Bảo quản ở tủ lạnh từ -200C đến -50C. b. Dung dịch HEPES 1M (100X)

Công thức pha dung dịch HEPES

Thành phần Hàm lượng

HEPES (MW=238.31) 23.831g

Trang 26

Vật liệu và Phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học

- Lọc với màng lọc 0.2 µm. - Bảo quản trong tủ mát ở 40C.

c. Dung dịch Sodium pyruvate 100mM, Glucose 2.5g/l

Công thức pha dung dịch Sodium pyruvate - Glucose

Thành phần Hàm lượng Glucose 0.25g Sodium pyruvate (MW=110.04) 1.1g PBS vừa đủ 100ml - Lọc với màng lọc 0.2 µm. - Bảo quản trong tủ mát ở 40C.

d. Dung dịch L-Glutamine 200mM (100X) (MW=146.15)

Công thức pha dung dịch L-Glutamine

Thành phần Hàm lượng

L-Glutamine 2.923g

PBS ( hoặc NaCl 0.85%) vừa đủ 100ml - Lọc với màng lọc 0.2 µm.

- Bảo quản trong tủ lạnh -200C (12 tháng) trong falcon 10ml, và ở 4oC trong các eppendorf 1ml.

e. Dung dịch 2-mercaptoethanol 1M

- Dùng stock ban đầu là dạng lỏng 78.13g/mol (1L=1.12kg). - Hút 70ul stock ban đầu, bổ sung thêm dH2O đến 1ml. - Lọc với màng lọc 0.2 µm.

f. Dung dịch NaOH 1N và HCl 1N

- Dung dịch NaOH 1N và HCl 1N hấp vô trùng ở 1210C, 1 atm trong 20 phút. g. Dung dịch kháng sinh

- Penicillin 100g/ml. - Streptomycin 100g/ml.

Trang 27

Vật liệu và Phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học

h. Dung dịch M-CSF 62 g/ml (1000X)

- Ống M-CSF đông khô 54.7ug, bổ sung 880 ul dH2O vô trùng. - Bảo quản trong tủ mát 40C.

 Hóa chất đếm tế bào

- Dung dịch Tryphan Blue 0.22%

 Thuốc thử

- Cell counting kit 8 (CCK-8) là hợp chất không phóng xạ, rất nhạy trong các thử nghiệm màu nhằm xác định số lượng tế bào sống trong thử nghiệm tăng sinh hoặc thử nghiệm gây độc.

- Thành phần của CCK-8 là WTS8 [2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4- nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, muối đơn natri], chất này bị khử bởi các dehydrogenase trong tế bào tạo ra sản phẩm có màu vàng (formazan), có thể

tan trong

môi trường

nuôi cấy.

Lượng

formazan tạo thành trong phản ứng dehydrogenase tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống. CCK-8 có độ nhạy cao hơn các muối tetrazolium khác như MTT, XTT, MTS hay WST-1.

Hình 2.1. Phản ứng dehydrogenase ở tế bào sống biến đổi WTS-8 thành sản phẩm màu (formazan)

Trang 28

Vật liệu và Phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học

- Độ hấp thu tự nhiên (Spontaneous absorbance) của môi trường nuôi cấy ủ CCK- 8 là khoảng 460nm. Độ hấp thu này có thể thay đổi phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy, pH, thời gian ủ và thời gian phơi sáng. Giá trị OD khi ủ CCK-8 trong 2h là khoảng 0.1-0.2 đơn vị hấp thu. Để đảm bảo tính chính xác, luôn ủ kèm một hoặc vài giếng âm không chứa tế bào, và trừ giá trị độ hấp thu các giếng còn lại cho giếng âm để được kết quả OD cuối cùng.

- CCK-8 có thể sử dụng và bảo quản trong vòng 2 năm ở -200C, 1 năm ở 40C và 6 tháng ở nhiệt độ phòng, trong điều kiện không có ánh sáng. Đông lạnh và rã đông liên tục ảnh hưởng đến kết quả phản ứng màu, do đó nên để ở 40C khi cần sử dụng liên tục.

 Hóa chất gây suy tủy

- Cyclophosphamide: tồn tại dưới dạng bột kết tinh màu trắng, có tên thương mại là Endoxan, do hãng Baxter Oncology GmbH (Đức) sản xuất và do Công ty cổ phần dược trung ương II nhập khẩu. Mỗi lọ Endoxan chứa thành phần hoạt chất: 213.8 mg cyclophosphamide monohydrate, tương ứng với 200 mg cyclophosphamide khan. Thuốc được bảo quản trong tối, ở 40C cho đến khi sử dụng.

 Hóa chất đếm bạch cầu

- Dung dịch ly giải hồng cầu dùng trong đếm bạch cầu tổng:

NH4Cl 8.28 g

KHCO3 1.0 g

EDTA 0.036 g

Nước cất hai lần thêm vừa đủ 1000 ml Chỉnh pH ở 7.4

Hấp khử trùng trước khi dùng - Thuốc nhuộm Giemsa

- Dung dịch Immersion oil 2.1.3. Môi trường

Trang 29

Vật liệu và Phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học

- Môi trường RPMI 1640 được phát triển bởi Moore và cộng sự tại Roswell Park Memorial Institute năm 1966. Công thức môi trường RPMI 1640 dựa trên thành phần của RPMI 1630 kết hợp sử dụng hệ thống buffer bicarbonate và có sự thay đổi lượng các axít amin và vitamin. RPMI 1640 thường được sử dụng để nuôi cấy tế bào người và tế bào bạch cầu ác tính.

- Môi trường RPMI 1640 dạng lỏng có màu cam, trong, pH 7.4, bảo quản 12 tháng kể từ ngày sản xuất. Môi trường RPMI 1640 dạng bột có thể sử dụng trong vòng 36 tháng kể từ ngày sản xuất. Cả 2 dạng này đều bảo quản ở tủ mát 4-80C.

Công thức pha môi trường RPMI 1640

Thành phần Hàm lượng

HEPES 1M 1ml

Sodium pyruvate 100mM, Glucose 2.5g/L 1ml L-Glutamine 200mM 1ml FBS 10ml 2-mercaptoethanol 1M 5µl RPMI 1640 vừa đủ 100ml

- Chỉnh pH môi trường đến 7.4 bằng dung dịch NaOH 1N. - Lọc vô trùng bằng màng lọc lỗ 0.2 µm.

- Bảo quản trong tủ mát ở 40C.

 Môi trường RPMI 1640 bổ sung M-CSF

Công thức pha môi trường RPMI 1640 bổ sung M-CSF

Thành phần Hàm lượng

HEPES 1M 1ml

Sodium pyruvate 100mM, Glucose 2.5g/l

1ml

L-Glutamine 200mM 1ml

Trang 30

Vật liệu và Phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2-mercaptoethanol 1M 5µl

M-CSF 62 ug/ml 100 µl

RPMI 1640 vừa đủ 100ml

- Chỉnh pH môi trường đến 7.4 bằng dung dịch NaOH 1N. - Lọc vô trùng bằng màng lọc lỗ 0.2 µm.

- Bảo quản trong tủ mát ở 40C. 2.1.4. Nguyên vật liệu

2.1.4.1. Dòng tế bào M-NFS-60

- Dòng tế bào M-NFS-60 cung cấp từ ATCC (No. CRL-1838TM).

- Dòng tế bào M-NFS-60 thu từ chuột trưởng thành (NFS X DBA/2) đã nhiễm

virus bệnh bạch cầu dòng tủy Cas Br-MuLV và có sự sát nhập gen tại vị trí c-myb

proto-oncogene.

- Đây là dòng tế bào tồn tại và tăng sinh dưới tác động của G-CSF, M-CSF và IL- 3, được sử dụng phổ biến trong các thử nghiệm sinh học G-CSF.

2.1.4.2. Chuột nhắt trắng Mus musculus var. Albino

- Chuột dùng cho thí nghiệm là chuột đực, đã trưởng thành, sạch bệnh, cân nặng khoảng 25g. Chuột được mua tại viện Pateur thành phố Hồ Chí Minh. Sau đó được nuôi và thí nghiệm tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học phân tử A, trường Đại học Khoa học Tự nhiên.

2.1.4.3. Leukocim

- Ior Leukocim có bản chất là Filgrastim, là một dạng G-CSF thương mại (r-Met- hu-G-CSF), được sản xuất tại công ty Center de Immunology Molecular (CIM). Thuốc được đóng gói trong lọ 1ml với hoạt tính là 1,0.108IU/mg. Thuốc sử dụng bằng cách tiêm dưới da hoặc tiêm vào tĩnh mạch.

2.1.4.4. Neupogen

- Neupogen là G-CSF tái tổ hợp thương mại dạng Filgrastim, có bản chất là một

protein 175 acid amin sản xuất từ E.coli tái tổ hợp gen G-CSF, có trọng lượng

18,8kDa, hoạt độ là 1,0 ± 0,6.108IU/mg. Thuốc do công ty Amgen sản xuất và hang Hoffmann - La Roche phân phối.

Trang 31

Vật liệu và Phương pháp Luận văn Thạc sĩ Sinh học

2.1.4.5. G-CSF tái tổ hợp

- G-CSF tái tổ hợp cung cấp từ các giai đoạn sản xuất của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học phân tử A.

2.2. Phương pháp