Hiệu quả kích thích tăng sinh bạch cầu trung tính của G-CSF sẽ khác nhau ở các nồng độ khác nhau. Ở nồng độ quá thấp, hiệu quả kích thích tăng sinh bạch cầu hạt sẽ ở mức thấp và khó nhận diện. Ngược lại với nồng độ quá cao lại làm giảm
Trang 65
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
khả năng tác động của G-CSF và có thể gây ra các tác dụng phụ không mong muốn.
Nồng độ G-CSF dùng cho thử nghiệm hoạt tính in vivo cần phải có hiệu quả kích
thích tăng sinh mạnh và nhạy, dễ dàng cho việc theo dõi đánh giá, phân tích kết quả. Mục tiêu của thí nghiệm nhằm chọn ra được nồng độ tối ưu cho quy trình thử
nghiệm hoạt tính G-CSF in vivo. Thí nghiệm được tiến hành khảo sát bằng cách sử
dụng G-CSF thương mại là Leukocim ở các nồng độ 1µg/kg, 5µg/kg và 10µg/kg trên mô hình chuột bệnh đã được xây dựng. Phân tích lượng bạch cầu trung tính trong máu chuột mỗi 4 giờ sau khi tiêm G-CSF, chúng tôi đánh giá hiệu quả của thuốc ở các nồng độ khác nhau.
Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Tương quan giữa % tăng bạch cầu trung tính và nồng độ G-CSF
-24h 0h 4h 8h Đối chứng 100±0 29±8 9±7 7±3 Leu 1 100±0 46±6 44±10 48±3 Leu 5 100±0 18±4 36±6 68±11 Leu 10 100±0 19±2 50±10 34±5 12h 16h 20h 24h Đối chứng 6±2 12±5 12±4 12±7 Leu 1 42±12 54±8 54±8 54±8 Leu 5 96±6 96±6 88±4 88±4 Leu 10 42±2 45±6 45±6 45±6
Trang 66
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính tương ứng với nồng độ G-CSF
Kết quả quan sát từ đồ thị và phân tích thống kê cho thấy ở cả ba nồng độ, G- CSF đều có tác dụng kích thích tăng sinh bạch cầu trung tính so với lô đối chứng. Tuy nhiên lượng bạch cầu trung tính chưa đạt mức như ban đầu và có xu hướng giảm sau 24 giờ tiêm thuốc. Điều này có thể giải thích do G-CSF có thời gian bán hủy trong huyết thanh là 3.5 giờ, tốc độ đào thải là 0.6ml/phút/kg, nên hiệu quả của G-CSF thường giảm sau 24 giờ. So sánh giữa ba nồng độ, chúng tôi nhận thấy hiệu quả kích thích tăng sinh ở nồng độ 1µg/kg và 10µg/kg tương đương nhau và đều thấp hơn so với nồng độ 5µg/kg. Đồng thời, ở nồng độ 5µg/kg, trạng thái chuột vẫn bình thường không có dấu hiệu tác dụng phụ. Từ đó chúng tôi chọn nồng độ G-CSF thử nghiệm là 5g/kg có hiệu quả kích thích tăng sinh bạch cầu trung tính cao mà không gây tác dụng phụ.
Dựa vào những kết quả của các thí nghiệm trên, chúng tôi đề xuất quy trình đánh giá hoạt tính G-CSF trên chuột như sau.
Trang 67
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
3.3.3. Xây dựng mô hình đánh giá tác động của G-CSF theo phác đồ điều trị Tiêm G-CSF một lần duy nhất chỉ cho biết hoạt tính của thuốc chứ chưa khảo sát được tác dụng điều trị bệnh tức là khả năng phục hồi lượng bạch cầu trung tính như trạng thái ban đầu. Nguyên nhân do đặc tính dược động học nên hiệu quả của thuốc thường giảm sau 24 giờ. Vì vậy, để chữa trị các bệnh liên quan đến suy giảm bạch cầu trung tính, cần phải tiêm thuốc theo phác đồ điều trị trong nhiều ngày. Có nhiều dạng phác đồ khác nhau tùy theo tình trạng bệnh, trong đó phát đồ tiêm G-CSF trong 4 ngày thường được sử dụng. Để có cơ sở đánh giá hiệu quả điều trị bệnh của G-CSF tái tổ hợp sản xuất, chúng tôi tiến hành xây dựng mô hình khảo sát tác dụng điều trị bệnh của G-CSF theo phác đồ điều trị 4 ngày dựa trên G-CSF thương mại là Leukocim với liều tiêm thuốc 5µg/kg. Kết quả được đánh giá thông qua khả năng phục hồi lượng bạch cầu trung tính như ban đầu trên cơ thể chuột
bệnh. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.11.
0, 4, 8, 12, 16, 20, 24giờ
Tiêm CPA (200mg/kg) trên chuột
Chuột suy giảm miễn dịch
(-): Tiêm NaCl 0.9% (+): Tiêm Leukocim 5g/kg Mẫu thử: Tiêm G-CSF 5g/kg
Khảo sát số lượng bạch cầu trung tính
Đánh giá hoạt tính G-CSF tái tổ hợp
Trang 68
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
Bảng 3.11. Sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính (%) sau khi tiêm Leukocim theo phác đồ điều trị
N0 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8
Đối chứng 100±0 23±8 24±9 15±2 15±2 7±4 46±5 46±5 46±5 Leukocim 100±0 24±8 114±9 118±4 124±5 135±7 125±7 119±2 127±10
Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi lượng bạch cầu trung tính sau khi tiêm Leukocim theo phác đồ điều trị
Dựa vào đồ thị, chúng tôi nhận thấy ở lô đối chứng, sau khi được tiêm CPA, chuột có số lượng bạch cầu trung tính giảm, khoảng dưới 1000 tế bào/mm3, tình trạng này được xem là trạng thái của bệnh Neutropenia, và được duy trì trong khoảng 6 ngày.
Trong khi đó ở lô chuột thí nghiệm được tiêm G-CSF liên tục trong bốn ngày, lượng bạch cầu trung tính tăng cao, trở về mức bình thường như ban đầu trước khi gây suy giảm miễn dịch. Tiếp tục theo dõi số lượng bạch cầu trung tính sau khi dừng phác đồ điều trị, chúng tôi nhận thấy lượng bạch cầu trung tính vẫn ổn định ở mức bình thường. Kết quả này cho thấy khi tiêm G-CSF ở nồng độ 5µg/kg
Tiêm G-CSF Tiêm CPA
Trang 69
Kết quả và Biện luận Luận văn Thạc sĩ Sinh học
liên tục trong 4 ngày sẽ giúp chuột phục hồi và duy trì ổn định lượng bạch cầu trung tính trong máu ngoại vi.
Như vậy dựa vào mô hình này, chúng tôi có thể đánh giá hiệu quả điều trị bệnh của G-CSF tái tổ hợp sản xuất. Mô hình có thể được tóm tắt như sau:
3.4. Áp dụng quy trình để đánh giá hoạt tính G-CSF tái tổ hợp in vivo
Từ quy trình đã được xây dựng, chúng tôi tiến hành thử nghiệm các mẫu G- CSF do phòng thí nghiệm Sinh học phân tử A sản xuất để đánh giá hoạt tính của protein so với sản phẩm thương mại là Leukocim cũng như bước đầu xem xét tác động của G-CSF lên cơ thể động vật.