2. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.4.4. Xác ñịnh chỉ số TCID
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 32
Chuẩn bị mơi trường:
Mơi trường MEM khơng đầy đủ có bổ sung 1% kháng sinh, kháng nấm. Môi trường MEM duy trì có bổ sung 1% huyết thanh bào thai bê và 1% kháng sinh, kháng nấm.
Bảng 2.1. Sơ ñồ pha loãng vi rút
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 10-1 10-1 10-1 10-1 10-1 A 10-1 10-1 10-1 10-1 10-1 B 10-2 10-2 10-2 10-2 10-2 C 10-3 10-3 10-3 10-3 10-3 D 10-4 10-4 10-4 10-4 10-4 E 10-5 10-5 10-5 10-5 10-5 F 10-6 10-6 10-6 10-6 10-6 G 10-7 10-7 10-7 10-7 10-7 H 10-8 10-8 10-8 10-8 10-8 Chuẩn bị vi rút:
Vi rút ñược pha loãng trên ñĩa 96 giếng theo cơ số 10 từ 10-1 đến 10-8 trong mơi trường MEM khơng đầy ñủ. Mỗi ñộ pha lỗng được tiến hành trên dãy 5 giếng, tiến hành theo sơ ñồ (bảng 2.1)
Cho vào các giếng từ A1-5 ñến H1-5, mỗi giếng 135µl mơi trường MEM khơng đầy đủ.
Cho vào các giếng từ A1-A5, mỗi giếng 15µl huyễn dịch vi rút.
Dùng pipette đa kênh trộn đều, chuyển 15µl từ hàng A sang hàng B. Thực hiện như vậy cho ñến hàng H, hút bỏ 15µl huyễn dịch.
Chuẩn bị tế bào:
Tế bào MDCK được ni cấy trên ñĩa 96 giếng, bao phủ 80%.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 33
Bảng 2.2. Sơ ñồ thực hiện chuẩn ñộ vi rút
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12, A 10-1 10-1 10-1 10-1 10-1 ðCTB A 10-1 10-1 10-1 10-1 10-1 ðCTB B 10-2 10-2 10-2 10-2 10-2 ðCTB C 10-3 10-3 10-3 10-3 10-3 ðCTB D 10-4 10-4 10-4 10-4 10-4 ðCTB E 10-5 10-5 10-5 10-5 10-5 ðCTB F 10-6 10-6 10-6 10-6 10-6 ðCTB G 10-7 10-7 10-7 10-7 10-7 ðCTB H 10-8 10-8 10-8 10-8 10-8 ðCTB
Ghi chú: ðCTB: ðối chứng tế bào, không gây nhiễm vi rút
Các bước tiến hành
Bước 1. Gây nhiễm vi rút trên tế bào MDCK
- Loại bỏ mơi trường ni cấy trong đĩa 96 giếng. - Rửa tế bào bằng dung dịch PBS-, 200µl/giếng, loại bỏ.
- Chuyển 100 µl vi rút đã pha loãng lần lượt vào các giếng tương ứng trên ñĩa tế bào, ñối chứng tế bào (ðCTB) cho 100 µl mơi trường MEM duy trì vào mỗi giếng.
- Ủ trong tủ ấm 370C, 5% CO2 trong 30 phút.
Bước 2. Thay môi trường
- Loại bỏ huyễn dịch trong các giếng.
- Rửa tế bào bằng dung dịch PBS-, 200 µl/giếng, loại bỏ PBS. - Cho 150 µl/giếng mơi trường MEM duy trì.
- Ni trong tủ ấm 370C, 5% CO2.
Bước 3. Theo dõi sự biến ñổi của tế bào MCDK hàng ngày (trong 5 ngày),
ghi nhận giếng có CPẸ
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 34 TCID50 ñược xác ñịnh như là độ pha lỗng (hay ñậm ñộ) ở ngưỡng cần thiết của một huyễn dịch vi rút xác ñịnh vừa ñủ ñể gây nhiễm ñược 50% tế bào cảm thụ. Việc xác ñịnh trị số TCID50 dựa vào tác ñộng huỷ hoại tế bào của vi rút (CytoPathic Effect, CPE) và việc xác ñịnh ñược CPE trong thí nghiệm chuẩn độ. Quan sát dưới kính hiển vi và đếm số giếng có CPE sau 5 ngàỵ Sử dụng cơng thức Reed-Muench để tính chỉ số TCID50 của vi rút.