2 A/Duck/VNBN/06/1 88 3 13 Cao
3.2.4.Trình tự axit amin tại cleavage site của chủng phân lập
Thành phần và trình tự amino acid kiềm tại điểm cắt (HA0 clevaege site) tách H1 và H2 protein mã hóa trong gene H là một trong những đặc điểm nhận dạng vi rút cúm gia cầm có độc lực cao hay thấp. Trình tự nucleotide và axit amin tại cleavage site của 10 chủng vi rút sử dụng trong nghiên cứu này ñược trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Trình tự Amino acid tại cleavage site
TT Tên chủng Amino acide
1 A/Duck/VNNB/03/10 PQRERRRKRGLF 2 A/Ck/VNVP/03/11 PQRERRRKRGLF 2 A/Ck/VNVP/03/11 PQRERRRKRGLF 3 A/Ck/VNHD/04/11 PQRERRRKRGLF 4 A/Ck/VNQT/06/11 PQRERRRKRGLF 5 A/Duck/VNHD/07/11 PQRERRRKRGLF 6 A/MD/VNHD/01/12 PQRERRRKRGLF 7 A/Ck/VNVP/03/12 PQRERRRKRGLF 8 A/Ck/VNTB/10/12 PQRERRRKRGLF 9 A/Ck/VNHP/05/12 PQRERRRKRGLF 10 A/Duck/VNBN/06/12 PQRERRRKRGLF
Theo khuyên cáo của OFFLU, hồn tồn có thể nhận dạng vi rút cúm gia cầm thể độc lực cao qua clevaege sitẹ Trình tự của HA0 clevaege site của các vi rút cúm gia cầm được chia thành hai nhóm độc lực cao và thấp, tùy thuộc vào số lượng axit amin kiềm (Offlu, 2013).
Cả 10 chủng vi rút trong nghiên cứu này đều có clevaege site là PQRERRRKRGLF 10 axit amin kiềm, cho thấy, đặc tính chủng độc lực cao do đặc tính di truyền của clade 2.3.2.1 quyết định, trình tự 10 axit amin kiềm này hoàn toàn phù hợp với clevaege site của H5N1 Eurasian-African lineagẹ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 51 Kết quả ở bảng 3.5 và 3.6 cho biết 10 chủng vi rút phân lập sử dụng trong nghiên cứu này có chỉ số IVPI lớn hơn 1.2 và trình tự axit amin tại HA0 đặc thù của chủng vi rút cúm gia cầm có độc lực cao phù với các tiêu chí của OIẸ
3.3. ðặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút clade 2.3.2.1B
ðể nghiên cứu đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm gia cầm phân lập ở các ñịa phương và theo thời ñiểm khác nhau từ 10/2010 ñến tháng 2/2012, chúng tơi đã chế kháng thể đa dịng cho 3 chủng vi rút theo 3 nhánh phát sinh lồi: Các chủng vi rút đã được sử dụng để chế kháng huyết thanh là chủng vi rút cúm A/Duck/VNNB/03/10, A/Ck/VNVP/03/11, và A/Duck/VNBN/06/12 ; kháng huyết thanh có tên tương ứng tại bảng 3.7 là NB/03/10, VP/03/11 và BN/06/12. Mỗi kháng huyết thanh lần lượt ñược thực hiện HI với mỗi chủng vi rút phân lập, kết quả lập lại 5 lần ñược xem là chỉ số HI miễn dịch chéo giữa các chủng và được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Chỉ số HI(log2) miễn dịch chéo giữa các chủng vi rút phân lập Kháng huyết thanh TT Kháng nguyên NB/03/10 VP/03/11 BN/06/12 1 A/Duck/VNNB/03/10 8,00 5,80 6,20 2 A/Ck/VNVP/03/11 5,80 8,00 6,40 3 A/Ck/VNHD/04/11 5,60 7,80 6,60 4 A/Ck/VNQT/06/11 5,60 7,60 6,80 5 A/Duck/VNHD/07/11 5,40 7,40 6,80 6 A/MD/VNHD/01/12 5,40 7,40 7,00 7 A/Ck/VNVP/03/12 5,20 6,80 7,80 8 A/Ck/VNTB/10/12 5,00 6,60 7,60 9 A/Ck/VNHP/05/12 5,20 6,80 7,80 10 A/Duck/VNBN/06/12 5,20 6,60 8,00 Trung bình 5,22 ± 0,86 6,62 ±0,67 6,71 ±0,63
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 52
Nhận xét :
(1) ðối với một kháng huyết thanh, chỉ số HI là khác nhau khi sử dụng các chủng phân lập khác nhau, chứng tỏ đặc tính kháng ngun của các chủng là khác nhau: Với kháng huyết thanh NB/03/10, chỉ số HI dao ñộng trong khoảng 5,00 ñến 8log2 ; ñối với kháng huyết thanh VP/03/11, chỉ số HI dao ñộng từ 5,80 ñến 8,00log2và BN/06/12 là từ 6,20 ñến 8,00log2. Chỉ số HI cao nhất tương ứng với cặp kháng nguyên-huyết thanh kháng chính chủng ñã ñược sử dụng ñể chế huyết thanh. BN/06/12 có hiệu giá HI cao với các chủng vi rút phân lập năm 2012 nhưng giảm dần so với các chủng vi rút phân lập lần lượt ở các năm 2011 và năm 2010.
Nhận xét này chứng tỏ các chủng vi rút có quan hệ họ hàng gần gũi, trong cùng một clade có đặc tính kháng nguyên khác nhaụ
(2) Ba chủng vi rút sử dụng ñể chế kháng huyết thanh thuộc về ba nhánh của cây phả hệ ở hình 3.1 tương ứng với một chủng cho mỗi năm 2010, 2011 và 2012 (bảng 3.1). Nhìn chung, chỉ số HI miễn dịch chéo là khá cao ñối với các chủng phân lập cùng năm và thấp hơn ñối với các chủng phân lập ở các năm khác. Huyết thanh kháng chủng A/Ck/VNVP/03/11 có hiệu giá HI cao ñối với các chủng phân lập cùng năm 2011 nhưng giảm >1log2 với các chủng phân lập năm 2012, thậm chí >2log2 với chủng phân lập năm trước đó. Hiện tượng này có thể phản ánh sự giảm tương ñồng kháng nguyên theo thời gian của các chủng vi rút cúm gia cầm thậm chí trong cùng một cladẹ
(3) Trong khi chấp nhận sự ña dạng kháng nguyên của các chủng vi rút gây dịch ở các ổ dịch khác nhau (tính kháng nguyên khơng hồn tồn tương đồng) và thậm chí sự song song tồn tại các vi rút mới, trên nền của chủng ñang lưu hành (xem ở hình 3.1), việc lựa chọn được một chủng ñại diện cho một clade làm ứng viên sử dụng trong thử thách cường ñộc ñể ñánh giá khả năng bảo hộ của văc xin là rất cần thiết. Có thể nói chủng có đặc tính kháng ngun gần nhất với ña số các cá thể chủng vi rút trong số đã phân lập là chủng mang tính ñại diện cao hơn về đặc tính kháng ngun. Giá trị trung bình ở bảng 3.7 cho thấy đối với
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 53 3 chủng vi rút ñã ñược sử dụng ñể chế huyết thanh, chủng A/Duck/VNBN/06/12 (chỉ số HI trung bình là 6,71 ± 0,63log2) có thể có quan hệ kháng nguyên gần gũi với 9 chủng còn lại cao hơn so với chủng A/Ck/VNVP/03/11 (6,62 ± 0,67log2) và thấp nhất là với chủng A/Duck/VNNB/03/10 (5,22 ± 0,86log2) ñã ñược sử dụng ñể chế kháng huyết thanh tương ứng.
(4) ðặc tính miễn dịch chéo là khơng đồng nhất giữa cặp [huyết thanh A + Kháng nguyên B] và [huyết thanh B + Kháng nguyên A], thí dụ kháng huyết thanh NB/03/10 cho chỉ số HI là 5,20log2 khi ngăn trở ngưng kết với kháng nguyên chủng A/Duck/VNBN/06/12, nhưng cặp kháng huyết thanh BN/06/12 + kháng nguyên vi rút chủng A/Duck/VNNB/03/10 cho hiệu giá HI là 6,20log2, cao hơn 1 ñơn vị log2. Tuy mới chỉ thực hiện phản ứng HI chéo với kháng huyết thanh từ 3 chủng, kết quả ở bảng 3.7 cho thấy xu hướng chủng xuất hiện sau cho chỉ số HI miễn dịch chéo trung bình cao hơn các chủng trước đó. Do trong thí nghiệm này kháng huyết thanh ñã ñược chế từ kháng ngun tồn vi rút, có thể nhận ñịnh kết quả này phù hợp với nguyên tắc di truyền tiến hóa chung là chủng mới cịn mang đặc tính của chủng cũ nhưng chủng cũ chưa có các đặc tính của chủng mớị
Kết quả trình bày ở các mục 3.1 ñến 3.3 trên ñây chứng tỏ trong nghiên cứu này, chúng tơi đã tiến hành xác định đặc tính của các các chủng vi rút cúm gia cầm có độc lực caọ Mặc dù các chủng vi rút có quan hệ di truyền và phát sinh lồi rất gần gũi, độc lực của chúng khác nhau trên phôi trứng gà 10 ngày tuổi và trên tế bào MDCK. Nhằm tiến tới lựa chọn được chủng có đặc tính kháng ngun chung, có thể đại diện cho nhóm chủng vi rút đã phân lập, kết quả xác định đặc tính kháng nguyên một cách gián tiếp thông qua miễn dịch chéo cho thấy có thể lựa chọn chủng vi rút A/Duck/VNBN/06/12 cho các nghiên cứu tiếp theọ Chủng A/Duck/VNBN/06/12 có các đặc tính : (i) Là chủng vi rút có ñộc lực cao thuộc calde 2.3.2.1B với 9 chủng cùng nhóm (ii) Thích ứng và phát triển tốt trên phơi trứng gà 10 ngày tuổi và trên nuôi cấy tế bào MDCK; (iii) Có độc lực cao nhất trên phơi trứng : Gây chết phơi sau khi tiêm trung bình ở 27 giờ và có liều gây chết 50% phơi trung bình thấp nhất (100 µl, ELD50 = 10-6,30) ; (iv) Có
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 54 quan hệ kháng nguyên tính gần gũi nhất với các chủng phân lập khác trong cùng clade 2.3.2.1B.
Ở phần kế tiếp chúng tơi trình bày những nghiên cứu về ñộc lực trên ñộng vật thí nghiệm chỉ với chủng vi rút cúm A/Duck/VNBN/06/12 ñã lựa chọn nàỵ
3.4. ðộc lực của vi rút A/Duck/VNBN/06/12 trên gà
Trong nghiên cứu về ñộc lực của chủng A/Duck/VNBN/06/12, với mục tiêu xác ñịnh ñược liều gây chết gia cầm ổn định, chúng tơi xác ñịnh liều gây chết 50% ñộng vật thí nghiệm, đồng thời đánh giá tính ổn định của ñộc lực của chủng lựa chọn sau khi tiếp đời trên phơi trứng
3.4.1. Kết quả xác ñịnh LD50 của chủng A/Duck/VNBN/06/12
Thí nghiệm xác định LD50 được tiến hành trên gà 3 tuần tuổi chưa có miễn dịch đối với vi rút cúm gia cầm như trình bày tại phần vật liệu và phương pháp. Thí nghiệm được lập lại 3 lần, liều gây chết 50% gà thí nghiệm trung bình và thời gian gây chết gà trung bình được trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. LD50 của chủng vi rút A/Duck/VNBN/06/12 trên gà
Lần thí nghiệm LD50 (log) MDT (giờ)
1 5,10 42,20
2 4,70 41,20
3 5,10 40,80
Trung bình 4,97± 0,23 41,40 ± 0,72 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhận xét : Kết quả xác ñịnh LD50 trên gà 3 tuần tuổi ở bảng 3.8 cho biết: (1) Chủng vi rút A/Duck/VNBN/06/12 có độc lực cao trên gà cảm thụ 3 tuần tuổi, gây chết 50% gà thí nghiệm tại liều 200 µl vi rút pha lỗng trong nước sinh lý tại nồng độ 10-4,97± 0,23, trong vịng 41,40 ± 0,72 giờ.
(2) Gà thí nghiệm chết với các triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh cúm gia cầm: Bỏ ăn, chảy nước rãi, thường có động kinh, chân tụ huyết và xuất huyết, phổi và đường hơ hấp trên nhiều dịch nhớt…
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……………………… 55 (3) Gà thí nghiệm bị chết nhanh sau gây nhiễm với các triệu chứng, bệnh tích điển hình chứng tỏ vi rút A/Duck/VNBN/06/12 là chủng có ñộc lực rất cao ñối với gà.
Liều gây chết 100% gia cầm: ðể khảo sát và ñánh giá liều sử dụng trong
thử thách cường độc, chúng tơi kiểm tra khả năng gây chết gà cảm thụ ở hai liều 100 và 10 LD50. Sử dụng 100 LD50 chúng tơi ln thu được kết quả 100% gà thí nghiệm bị chết ; Sử dụng liều 10 LD50 chúng tơi thu được kết quả 29/30 gà chết trong 3 lần lặp lạị