1.4.1. Sơ lƣợc về phƣơng pháp sắc ký
1.4.1.1.Các thông số cơ bản của sắc ký
Hình 1.5. Các thông số cơ bản của sắc ký a. Thời gian lưu tR
Là thời gian để chất phân tích sau khi tiêm vào cột đến đầu dò, được tính bằng công thức: o R R t t t ' ' R
t : Thời gian lưu hiệu chỉnh;
0
t : Thời gian lưu chết của cấu tử không bị giữ lại trên cột. t0 có thể được tính gần đúng theo công thức
V dc L t0 0,5 2 L: chiều dài cột, cm dc: đường kính cột, cm V: tốc độ dòng pha động, mL/phút
Có thể nhận danh chất thông qua thời gian lưu vì trong cùng điều kiện thí nghiệm trên một thiết bị sắc ký lỏng nhất định, thời gian lưu của chất đó là một đại lượng xác định.
Trang 17
Hệ số dung lượng k'là đại lượng quan trọng nhất trong sắc ký, mô tả mức độ lưu của chất phân tích trong cột, được tính theo công thức sau:
M S M M S S V V K V C V C k ' o R o R t t t t t ' 0 S V : thể tích pha tĩnh M V : thể tích pha động S
C : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh
M
C : nồng độ cấu tử trong pha động
- k'vừa tùy thuộc vào bản chất của chất tan, bản chất của pha tĩnh của cột và pha động.
- k' 0: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại.
- k'càng lớn, thời gian phân tích càng kéo dài, mũi có khả năng bị dãn - rộng do chất phân tích bị giữ lâu trong cột.
- Khoảng k'lý tưởng là 25, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, - '
k có thể chấp nhận trong khoảng 110.
c. Hiệu năng
Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết (ký hiệu N) của cột đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký của các cấu tử trên cột. Ncàng lớn, hiệu quả tách càng cao. 2 2 2 / 1 16 54 , 5 W t W t N R R W: bề rộng mũi sắc ký 2 / 1
W : bề rộng của mũi ở phân nửa chiều cao
Số đĩa lý thuyết càng lớn, bề rộng Wcàng nhỏ, mũi càng thon
d. Độ chọn lọc
Độ chọn lọc đặc trưng cho khả năng tách của 2 cấu tử cần phân tích A và B
Trang 18 o A R o B R A B A B t t t t k k K K '' (( ))
- càng lớn thì khả năng tách càng cao = 1 thì hai chất không thể tách được.
- phụ thuộc rất nhiều vào bản chất pha tĩnh, thành phần pha động, pH môi trường, nhiệt độ, …
e. Độ phân giải RS
Độ phân giải RS là một thông số dùng để đánh giá khả năng tách của hai mũi sắc ký. Độ phân giải được tính như sau:
N k k W W t t R B B B A A R B R S 2[ ]14 1 ' 1 ' ) ( ) (
Để có thể phân tích một cách định lượng, hai mũi kế nhau phải tách nhau hoàn toàn, tức làRS 1,3. Khi Rs < 1,3 thì cần phải thay đổi các thông số thực nghiệm để làm tăngRS.
* Nhận xét và kết luận
Để có thể phân tích một cách định lượng bằng phương pháp sắc ký khí thì cần phải chú ý đến khả năng tách của các mũi trên sắc ký đồ. Tùy theo điều kiện cụ thể mà chúng ta sẽ tối ưu hóa các thông số thực nghiệm của pha động (khí mang) cũng như pha tĩnh (cột sắc ký) cho hợp chất cần nghiên cứu.
1.4.1.2. Phương pháp sắc ký khí[4],[5],[26]
Sắc ký khí là một phương pháp tách và phân tích các hợp chất dễ bay hơi, được sử dụng rộng rãi và phổ biến hiện nay vì nhiều lý do: có độ nhạy tương đối thích hợp cho việc tách các cấu tử dễ bay hơi ra khỏi nhau và định lượng chúng. Sắc ký khí được ứng dụng rộng rãi từ phòng thí nghiệm đến công nghiệp đặc biệt là lĩnh vực thực phẩm, môi trường, dầu khí.
Đối tượng có thể phân tích bằng sắc ký khí tương đối đa dạng: các loại khí thải trong công nghiệp, dung môi hữu cơ, độ tinh khiết của hợp chất, thuốc trừ sâu, kháng sinh, tinh dầu…
Trang 19
Tùy theo loại hợp chất phân tích, tính chất và yêu cầu mà người ta sử dụng sắc ký khí với các loại đầu dò khác nhau.
a. Thiết bị sắc ký khí
Hình 1.6. Mô hình thiết bị sắc ký khí
Thiết bị sắc ký khí bao gồm van tiêm mẫu (injector :2), khí mang (1), cột sắc ký (Column: 3), đầu dò (Detector: 4) và phần điều khiển và xử lý dữ liệu (Data Processor: 5) hình 2.2
b. Nguyên lý hoạt động
Mẫu được tiêm vào van tiêm mẫu. Tại đây, mẫu được hóa hơi trước khi đi vào dòng khí mang. Dòng khí mang được chuyển qua cột sắc ký. Dựa vào khả năng tương tác của những cấu tử với pha tĩnh mà chúng sẽ được tách khỏi nhau và được ghi nhận sau khi ra khỏi cột bởi đầu dò.
Sắc ký khí có thể ghép với nhiều loại đầu dò khác nhau như:đầu dò ion
hóa ngọn lửa (FID: Flame Ionization Detector), đầu dò dẫn nhiệt (TCD: Thermal Conductivity Detector), đầu dò bắt electron hoặc công kết
electron (ECD: Electron Capture Detector), đầu dò ion hóa quang học (PhotoIonization Detector), đầu dò quang kế ngọn lửa (FPD), đầu dò đo độ
dẫn điện hóa (Hall Electrolytic Conductivity Detctor), đầu dò khối phổ (MSD: Mass Spectrometer Detector). Hiện nay, đầu dò khối phổ đang được ứng dụng rộng rãi trong phân tích vết và các hợp chất cần nhận danh và định lượng chính xác.
Trang 20
1.4.1.3.Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GCMS) [4],[26],[27],[28],[29],[30],[38]
GC-MS là phương pháp thường được dùng trong phân tích vết và các hợp chất cần nhận danh chính xác vì trong những điều kiện vận hành nhất định, ngoài thời gian lưu đặc trưng, hóa chất còn được xác nhận bằng khối phổ của nó. Độ nhạy của GC-MS tùy thuộc vào hợp chất cần phân tích và giao diện sử dụng.
a. Nguyên lý hoạt động
Trong sắc ký khí ghép khối phổ, hỗn hợp chất phân tích sau khi được tách ra khỏi cột sẽ đi qua một đường truyền đến đầu dò khối phổ. Tại đây diễn ra quá trình ion hóa. Ion sinh ra được tập trung và được đưa vào bộ phân tích khối. Mỗi ion phân tích sẽ có một giá trị m/z xác định, nhờ đó chúng được tách một cách chọn lọc ra khỏi bộ phân tích khối và tạo tín hiệu đặc trưng tại hệ thống phát hiện ion. Bộ phân tich khối có thể là một tứ cực (GCMS), ba tứ cực (GCMS/MS), bẩy ion, hay TOF…
b. Thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ
Thiết bị sắc ký khí ghép khối phổ bao gồm thiết bị sắc ký khí và đầu dò khối phổ.
Thiết bị sắc ký khí bao gồm van tiêm mẫu (Injector:1), khí mang (Carrier gas: 2), cột sắc ký (Column: 3).
Khối phổ bao gồm những bộ phận chính: buồng ion hóa (Ion source: 4), Nguồn tạo ion (Filament: 5), bộ chuyển ion (Lens: 6), tứ cực (Quadrupole: 7), đầu dò khối phổ (MS detector: 8), bộ điều khiển và xử lý dữ liệu (Data Proccessor: 9).
Trang 21
c. Các kiểu ion hóa trong sắc ký khí ghép khối phổ
Hiện nay, có hai kiểu ion hóa chính trong sắc ký khí ghép khối phổ là ion hóa điện tử và ion hóa hóa học.
Ion hóa điện tử
- Phân tử chất cần phân tích ở trạng thái hơi được đưa vào nguồn ion hóa đặt ở nhiệt độ cao (200-300oC). Electron tạo ra từ một dây tóc được nung nóng (Filament), được gia tốc lên 70 eV trước khi vào buồng ion hóa. Những electron đi vào buồng ion hóa và tương tác với các phân tử trung hòa được đưa vào từ cột sắc ký, chúng sẽ cung cấp năng lượng cần thiết để tách một điện tử ở phân lớp ngoài của phân tử trung hòa, như thế sẽ giải phóng một electron và một phân tử gốc tự do mang điện tích dương. Năng lượng mà điện tử (electron) cung cấp cho phân tử trung hòa đủ lớn để có thể phá vỡ cấu trúc ion dương mới tạo thành ra những mảnh ion mang điện tích dương nhỏ hơn đồng thời giải phóng các phân tử trung hòa hay gốc tự do.
M + e- M*+. + 2e- M*+. m+ + R*
M*+ m*+ + R
Mô tả quá trình ion hóa điện tử
b. Ion hóa hóa học (Chemical Ionization)
- Ion hóa hóa học dương (Positive Chemical Ionization)
Tương tự như ion hóa điện tử nghĩa là vẫn sử dụng dòng electron có năng lượng lớn. Điểm khác biệt chính là không ion hóa mẫu trực tiếp bằng
Trang 22
dòng electron ấy mà thay vào đó người ta cho dòng electron này ion hóa một chất khí (Reagent Gas: khí tác chất) được đưa vào buồng ion hóa như methane, ammoniac, hoặc isobutane.
CH4 + e- CH4+. + 2e- CH4+. CH3+ , CH2+. … CH4+. + CH4 CH5+ + CH3. CH3+ + CH4 C2H5+ + H2 CH5+ + M CH4 + MH+
Quá trình ion hóa này diễn ra nhanh trong buồng ion hóa tạo ra từ khí thêm vào các phân tử ion mang điện tích dương bền trong môi trường Plasma methane nhưCH5+, C2H5+. Người ta gọi chúng là những ion tác chất (reagent
Trang 23
ion). Những ion này là acid Bronsted mạnh, chúng sẽ ion hóa các phân tử chất phân tích thành ion dương bằng cách nhường một proton.
Hình 1.10. Ion hóa hóa học dương tạo ion dương từ chất phân tích
Không giống như ion hóa điện tử, các ion dương sinh ra MH+ bền hơn vì năng lượng cung cấp vào từ quá trình ion hóa ít hơn. Như vậy, ion MH+ sinh ra ít phân mảnh hơn và tín hiệu ion phân tử tăng lên
Ưu điểm của phương pháp ion hóa dương là tăng tín hiệu ion phân tử, giảm phân mảnh như mong muốn. Tuy nhiên, trong một số phân tử như alcohol bão hòa có dây dài thì quá trình proton hóa sẽ xảy ra trên nhóm chức, phân tử trung hòa sẽ mất nước và như vậy nếu ion phân tử có hiện diện thì tín hiệu cũng sẽ rất nhỏ.
Khi định lượng những hợp chất mà thời gian lưu nhỏ thì dung môi có thể đồng rửa giải với chất phân tích làm cho cường độ tín hiệu bị sai lệch vì dung môi có hoạt tính như một khí tác chất (reagent gas).
Ion hóa hóa học âm (Negative Chemical Ionization) Ion âm được tạo thành bằng hai quá trình
Quá trình 1: phân tử chất phân tích bắt giữ điện tử mang năng lượng thấp sinh ra:
Do sự ion hóa khí methane
Từ điện tử của filament có năng lượng giảm dần sau nhiều lần va chạm với khí methane
Trang 24
Quá trình 2: Phân tử chất phân tích cũng có thể bị phân mảnh bởi điện tử có năng lượng còn tương đối lớn.
Nói chung, điện tử mang năng lượng khoảng 5eV hoặc thấp hơn sẽ gắn vào những phân tử mẫu gọi là quá trình bắt giữ cộng hưởng (Resonance Capture) và như vậy ion phân tử âm được tạo thành. Nếu điện tử có năng lượng lớn hơn 5 eV thì phân tử mẫu có thể bị phá vỡ và ion phân tử âm có khối lượng phân tử nhỏ hơn được tạo thành. Quá trình này gọi là quá trình bắt giữ phân ly (Dissociative Capture). Như vậy, những hợp chất có halogen có ái lực với điện tử sẽ dễ dàng tạo ion âm.
Áp suất cao của khí tác chất cũng làm tăng số điện tử có năng lượng thấp do tăng số lần va đập và như thế sinh ra nhiều phân tử ion hơn. Tuy nhiên, tín hiệu giảm do quá trình chuyển ion bị găn chặn và độ ồn tăng lên, nguồn ion hóa sẽ bị bẩn nhanh và tuổi thọ đầu dò giảm nếu sử dụng khí tác chất dư.
M + e- M- M + e- A + B-
Mô tả quá trình ion hóa hóa học âm
Hình 1.11. Ion hóa hóa học âm
Trang 25
Đối với kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ như đã nêu ở trên, ngoài thời gian lưu của cấu tử cần phân tích người ta còn có thêm một dữ liệu rất quan trọng là khối phổ của cấu tử đó. Tùy vào mục đích nhận danh hay định lượng mà người ta sử dụng kỹ thuật quét (Scan mode) hoặc chọn lọc ion (SIM mode: Selected Ion Monitoring).
1.4.2.1. Kỹ thuật quét phổ (Scan Mode):
Kỹ thuật này thường được dùng để nhận danh các cấu tử bằng khối phổ, phân tích định lượng nếu nồng độ chất phân tích đủ lớn và xác định vài thông số cho chế độ SIM.
Khối phổ được lấy liên tục trong một khoảng thời gian (interval) ví dụ như 0,5 giây bằng cách thay đổi thế đưa vào tứ cực. Toàn bộ dữ liệu ghi nhận được lưu trên máy tính và có thể xử lý bằng phần mềm đi kèm.
Ví dụ: Sắc đồ full scan của benzene và benzene-d6 trong GCMS và khối phổ của nó
Hình 1.12. a. Sắc đồ full scan của benzene và benzene C6D6
Hình 1.12.b. Sắc đồ full scan của benzene và benzene C6D6 chọn m/z = 78; 84 Nhận xét: Trên hình 1.12.a , ở chế độ full scan hai mũi benzene và benzene C6D6 nằm gần như phủ lên nhau. Do đó, không thể phân tích định lượng benzene bằng kỹ thuật sắc ký khí thông thường khi có một hóa chất khác đồng rửa giải với benzene. Tuy nhiên, với đầu dò khối phổ ta có thể định lượng được mặc dù hai hóa chất đồng rửa giải (hình 1.12.b).
Benzene
Trang 26
Hình 1.13. Sắc đồ của Benzene (Scan Mode) và khối phổ Benzene từ thư viện NIST 2005
Hình 1.14. Sắc đồ của Benzene và Benzene-d6 (Scan Mode ) lấy lần lượt theo ion m/z 78 của Benzene và ion m/z 84 của Benzene-d6
m/z = 78 m/z =84 Benzene Benzene D6 m/ z Thời gian Benzene Nền Nền interval m/z = 78 m/z C ƣờ ng Đ ộ Thời gian
Trang 27
Nhận xét: Hình 1.14 cho thấy hoàn toàn có thể định lượng hai cấu tử đồng rửa giải theo chế độ full scan dựa vào ion định lượng của từng cấu tử.
1.4.2.2. Kỹ thuật chọn lọc ion (SIM Mode)
Những thông số về khối phổ được cài đặt sao cho dữ liệu chỉ ghi nhận tín hiệu của ion được chọn nghĩa là khi các ion qua tứ cực thì chỉ có ion định lượng đi vào detector còn các ion khác bị loại ra.
Kỹ thuật này thường được sử dụng trong phân tích định lượng vết khi đã biết khối phổ của chất yêu cầu , độ nhạy của nó cao gấp nhiều lần kỹ thuật scan.
Hình 1.15.a. Sắc đồ SIM của Benzene và Benzene C6D6
Hình 1.15.b.Sắc đồ đường nền của hai chế độ Scan và SIM trên m/z =84
Hình 1 16. SIM của Benzene (m/z =78) và Benzene D6 (m/z=84)
3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 (x100) Benzene Benzene D6 Cƣ ờng độ m/z = 78 m/z = 84 m/z Thời gian Benzene Benzene D6 Benzene D6 - FullScan Benzene D6 –SIM
Trang 28
Nhận xét : Ở chế độ SIM (chế độ chọn lọc ion), ảnh hưởng của tín hiệu nền thấp vì chỉ có ion định lượng đi vào detector. Do đó, độ nhạy phương pháp phân tích ở chế độ SIM tăng lên rất nhiều so với khi phân tích theo chế độ Full Scan.
Trang 29
PHẦN 2 NỘI DUNG
PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG BENZENE TRONG NƢỚC GIẢI KHÁT- KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SỰ TẠO THÀNH
BENZENE-ĐỀ XUẤT CƠ CHẾ HÌNH THÀNH BENZENE
2.1. ĐỊNH LƢỢNG BENZENE TRONG NƢỚC GIẢI KHÁT[19],[25],[27],[31],[32],[33],[36] KHÁT[19],[25],[27],[31],[32],[33],[36]
2.1.1. Thiết bị dụng cụ hóa chất
2.1.1.1. Thiết bị
- Hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ GCMS-QP2010 của Shimadzu gồm: + Hệ thống sắc ký khí GC2010
+ Cột sắc ký khí mao quản : 30m x 0,25mm x 0,25μm (5 % phenyl), SLB-5MS, Supelco hoặc tương đương
+ Đầu dò khối phổ một tứ cực : GCMS-QP2010-Shimadzu, Japan + Hệ thống tiêm mẫu tự động : Combi Pal AOC 5000 (Auto
Injector-Shimadzu)
+ Kim tiêm pha khí : Loại cho tiêm mẫu khí (gas tight) CTC Analysis, Hamilton USA + Phần mềm xử lý số liệu : GCMS Solution-Shimadzu + Thư viện nhận danh : NIST (USA) cập nhật 2005 - Buồng ủ mẫu phân tích : Có thể điều khiển được nhiệt độ - Cân phân tích độ chính xác 0,1mg : Sartorius CP225D, Germany