Kháng thể c-erB-2, kháng thể thứ hai cĩ gắn Biotin, Streptavidin, dung dịch 3,3’-diaminobenzidine chromogen (DAB). (Bộ kit Dako HerceptestTM )
Hematoxyline, Coper Sulfat, NH4OH, cồn, xylem, TBS, H2O2, nước cất, keo dán Baume Canada.
2.7.2 Thiết bị
Máy cắt, bể điều hịa nhiệt, Microwave, tủ lạnh, tủ sấy, pH kế, máy khuấy từ, kính hiển vi quang học, lam, lamel, micropipette, eppendoff, becher, ống đong, bình tam giác.
2.7.3 Phương pháp thực hiện
Quy trình nhuộm IHC gồm 5 bước chính như sau:
Bước 1: Cắt mẫu
Mẫu đã được cố định trong paraffin, đem cắt bằng máy microtome, kích thướt mỗi lát cắt là 4 – 6 μm.
Bước 2: Chuyển mẫu lên lam
Chuyển lát cắt vào nồi thả mơ, sau đĩ dùng lam dương vớt lát cắt lên lam. Bước 3: Khử paraffin
Mẫu sau khi được cốđịnh trên lam, sấy nĩng khoảng 30 phút, rồi nhúng vào xylen 2 lần, mỗi lần 2-5 phút. Sau đĩ chuyển sang cồn khoảng 2-5 phút. Rửa nước. Bước 4: Nhuộm IHC gồm các bước sau:
– Bộc lộ kháng nguyên trong Microwave với dung dịch Citrat pH = 6. Sau đĩ để nguội khỏang 20 phút và cho lên giá nhuộm. Rửa bằng TBS.
– Nhỏ khoảng 3 giọt H2O2 ủ 10 phút. Sau đĩ rửa bằng TBS.
– Phủ kháng thể thứ 1 khoảng 30 phút. Rửa TBS.
– Ủ với Biotin trong 30 phút. Rửa TBS.
– Ủ với Streptavidin trong 30 phút. Rửa TBS.
Cắt mẫu Chuyển mẫu lên lam Xử lý mẫu khử paraffin Nhuộm lam Đọc kết quả
– Làm hiển thị màu bằng DAB: 1ml dung dịch pha với 1 giọt DAB, ủ
trong 10 phút. Rửa nước. Sau đĩ ủ Coper sulfat khoảng 3 – 5 phút. Nhuộm tạo nền tương phản bằng cách nhúng lam trong dung dịch Hematoxylin khoảng 2 – 3 phút. Rửa nước. Tiếp theo nhúng vào dung dịch NH4OH rồi rửa lam qua nước, cồn, xylen. Cuối cùng chờ lam khơ và dán lamel với Baume Canada. (Lưu ý cần tránh cĩ bọt khí bên trong)
Bước 5: Đọc kết quả
Xem kết quả bằng kính hiển vi quang học. Đánh giá biểu hiện của HER2 theo bảng điểm của DAKO như sau:
– 0 : Màng tế bào khơng bắt màu
– 1+ : Bắt màu yếu, rải rác trên màng tế bào
– 2 +: Bắt màu vừa trên màng tế bào > 10% tế bào
Hình 2.1: Kết quả biểu hiện protein HER2 trong IHC
2.8 HĨA CHẤT, THIẾT BỊ TRONG PHƯƠNG PHÁP FISH 2.8.1 Hĩa chất 2.8.1 Hĩa chất
a. Bộ kit PathVysion: Bộ mẫu dị này lai với gen HER2 (SpectrumOrange) và
chromosome 17 centromere (SpectrumGreen). Bộ kit này gồm cĩ:
- LSI HER2/neu SpectrumOrange/ Cep17 SpectrumGreen DNA Probe
- DAPI Counterstain
- NP-40
- 20X SSC salts
b. Bộ kit Vysis Paraffin Pretreatment Reagent II: gồm cĩ
– Protease Buffer II: 0.2N HCL
– Protease: 2500 – 3000 U/mg protease, lyophilized
Ngồi những bộ kit kể trên, trong FISH cịn dùng những loại hĩa chất khác như xylen, cồn, nước cất, rubber cement.
2.8.2 Thiết bị
Kính hiển vi huỳnh quang, máy cắt microtome, bể điều hịa nhiệt, máy lai Thermobrite, máy lắc, máy ly tâm, máy khuấy từ, máy đo pH, bàn sấy lam, tủ sấy, tủ âm.
2.8.3 Phương pháp nhuộm FISH
a. Chuẩn bị mẫu
Cắt mẫu bằng máy cắt microtome khoảng 4 – 6 μm..
Chuyển lát cắt vào nồi nước ấm 40o C, sau đĩ dùng lam dương vớt lát cắt lên. Làm khơ lam.
Sấy lam qua đên ở 56 o C.
b. Khử paraffin trên lam
c. Paraffin pretreatment
- Nhúng lam vào dung dịch Pretreatment ở 80 o C trong 10 phút.
- Rửa nước cất 3 phút. Để khơ lam.
d. Xử lý protease
- Nhúng lam vào dung dịch Protease ở 37 o C trong 10 – 60 phút.
- Rửa nước cất 3 phút. Để khơ lam.
e. Khử nước Xylen 10 phút Xylen 10 phút Xylen 10 phút Cồn 100% 5 phút Cồn 100% 5 phút Cồn 70% (1 phút) Cồn 85% (1 phút) Cồn 100% (1 phút)
f. Giai đoạn biến tính và lai đồng thời, thực hiện trong buồng tối
- Nhỏ mẫu dị trên mẫu với lượng thích hợp. Sau đĩ dán lamel bằng rubber cement.
- Bắt đầu chương trình đồng lai ở 75 o C trong 5 phút và 37 o C trong 18 giờ bằng máy ThermoBrite.
g. Giai đoạn rửa sau lai, thực hiện trong buồng tối
Di chuyển rubber cement từ lam và nhúng lam vào dung dịch 2xSSC 0.3% NP-40 ở nhiệt độ phịng khoảng 1 phút.
Lấy lamel ra khỏi lam. Để lam khơ.
Nhúng lam vào trong dung dịch 2xSSC 0.3% NP-40 ở 72 o C khoảng 2 – 5 phút. Để lam khơ tự nhiên.
h. Giai đoạn nhuộm nhân tế bào, thực hiện trong buồng tối
– Nhỏ DAPI trực tiếp lên mẫu.
– Dán lamel.
– Cất lam trong hộp, giữ ở -20oC, 30 phút trước khi khảo sát dưới kính hiển vi huỳnh quang cĩ bộ lọc kính màu cam, xanh và DAPI.
i. Đọc kết quả
Kết quảđược phân tích theo khuyến cáo của ASCO/CAP 2007, đếm tín hiệu HER2 và CEP17 trên 20 nhân tế bào bướu rời, ở vùng ung thư xâm lấn. Trường hợp FISH khi sử dụng bộ kit PathVysion được xem là khuếch đại khi tỷ lệ HER2/CEP17 >2.2. Khi tỷ lệ HER2/CEP17 <1.8, hoặc cĩ ít hơn 4 tín hiệu ở mỗi nhân, kết quả
nhuộm FISH là khơng khuếch đại (theo Wolff, 2007). Cịn trường hợp tỷ lệ
HER2/CEP17 nằm trong khoảng từ 1.8 đến 2.2 hay cĩ trung bình 4 – 6 tín hiệu ở
mỗi nhân thì kết quả được xem là giáp biên. Những bệnh nhân cĩ kết quả này sẽ được xếp vào nhĩm khơng rõ ràng dù họ nhận cĩ được những lợi ích từ điều trị
Bảng 2.3: Cách đánh giá sự khuếch đại gen HER2 trong FISH
Trường hợp “giáp biên”, cần đếm thêm 20 tế bào khác, và tính tỉ lệ lại. Nếu tỉ lệ vẫn nằm trong khoảng 1,8 – 2,2 thì cần một người khác đọc và đếm lại. Sau đĩ tính trung bình trên 60 tế bào.
Khơng khuếch đại Khuếch đại gen
Hình 2.2: Kết quả khuếch đại gen HER2 trong kỹ thuật FISH
2.9 CHỨNG DƯƠNG VÀ CHỨNG ÂM
Mơ ung thư vú đã biết âm tính và dương tính trước đĩ.
2.10 XỬ LÝ SỐ LIỆU: dùng phần mềm SPSS16.0 Tỉ lệ HER2/CÉP 17 Đánh giá Tỉ lệ HER2/CÉP 17 Đánh giá < 1,8 Khơng khuếch đại 1,8 – 2,2 Giáp biên 2,3 – 3,9 Khuếch đại thấp ≥ 4 Khuếch đại cao
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
3.1 PHÂN BỐ BỆNH NHÂN THEO TUỔI Bảng 3.1: Phân bố nhĩm tuổi Độ tuổi Số trường hợp < 35 12 35 - 49 145 ≥ 50 143 Tổng cộng 300 Biểu đồ 3.1: Phân bố tỷ lệ nhĩm tuổi
Trong nghiên cứu này, bệnh nhân nữ cĩ độ tuổi dao động từ 29-82 tuổi, chúng tơi phân bố thành 3 nhĩm: nhĩm < 35 tuổi, nhĩm 35-49 tuổi và nhĩm cịn lại từ 50 tuổi trở lên. Theo biểu đồ 3.1, nhĩm tuổi thường gặp nhất là 35-49 tuổi, chiếm 48,3%, nhĩm ≥ 50 tuổi chiếm 47,7%, cịn lại là nhĩm < 35 tuổi là ít gặp nhất (4%).
Bàn luận:
Trong các nghiên cứu trước, nguy cơ mắc ung thư vú theo suốt cuộc đời người phụ nữ. Người ta nhận thấy rằng nguy cơ mắc bệnh này hiếm gặp ở lứa tuổi dưới 30, tăng dần đến độ tuổi 50, sau mãn kinh tần suất này tăng chậm lại. Tuy nhiên, ở
các nước Âu Mỹ, tần suất mắc carcinơm vú tăng lên theo tuổi và cĩ đến 74% trường hợp là phụ nữđã mãn kinh.
Kết quả của nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu trong nước của tác giả Lê Quốc Sử và cộng sự trên 300 trường hợp, nhĩm tuổi cĩ tỷ lệ cao nhất là 35-49 tuổi, nghiên cứu của tác giả Nguyễn Sào Trung và cộng sự trên 371 trường hợp và nghiên cứu của tác giả Âu Nguyệt Diệu trên 600 trường hợp, nhĩm tuổi cao nhất cũng là nhĩm 35-49 tuổi và nghiên cứu của Silvia Ess và cộng sự trên 4749 trường hợp, nhĩm tuổi cĩ tỷ lệ cao nhất là ≥ 50 tuổi. Bảng 3.2: So sánh phân bố tuổi với các nghiên cứu khác Nghiên cứu Tuổi < 35 35-49 ≥ 50 Nghiên cứu này 4% 48,3% 47,7% Lê Quốc Sử và c.s. [9] 9,3% 53,3% 37,4% Nguyễn Sào Trung và c.s. [11] 8,3% 53,3% 38,3% Âu Nguyệt Diệu và c.s. [3] 6% 55,2% 38,8% Silvia Ess et al. [35] 1,9% 21% 79%
3.2 PHÂN LOẠI MƠ HỌC
Kết quả phân loại mơ học được trình bày ở bảng dưới đây:
Bảng 3.3: Phân bố loại mơ học
(CAR. OTV: carcinơm ống tuyến vú
NOS - Not Otherwised Specific: khơng đặc hiệu)
Loại mơ học Số trường hợp CAR. OTV dạng NOS 277
CAR. dạng tiểu thùy 8
CAR. OTV dạng nhầy 7
CAR. OTV dạng nhú 2
CAR. OTV dạng chuyển sản 2
CAR. OTV dạng tủy 2
CAR. OTV dạng đỉnh tiết 1
CAR. OTV dạng ống nhỏ 1
Tổng cộng 300
Kết quả nghiên cứu ở Biểu đồ 3.2 cho thấy carcinơm ống tuyến vú dạng NOS chiếm tỷ lệ cao nhất 92,3%, đứng hàng thứ hai là carcinơm xâm lấn dạng tiểu thùy chiếm 2,7%, tiếp đến là carcinơm ống tuyến vú dạng nhầy chiếm 2,3%, carcinơm xâm lấn dạng nhú, chuyển sản và tủy cùng chiếm 0,7%, carcinơm ống tuyến vú xâm lấn dạng tủy và ống nhỏ chiếm tỷ lệ thấp nhất 0,3%.
Bàn luận:
Carcinơm xâm lấn là những khối u đã phát triển và xâm lấn vào xung quanh. Carcinơm xâm lấn tiến triển qua các giai đoạn: xâm lấn, di căn, hạch vùng, di căn xa. Carcinơm xâm lấn cĩ nhiều dạng, trong đĩ carcinơm xâm lấn dạng NOS cĩ tốc
độ diễn tiến nhanh. Tùy từng loại, các carcinơm ống tuyến vú xâm lấn sẽ cĩ biểu hiện dấu chứng sinh học khác nhau, do đĩ biểu hiện hình ảnh mơ học cũng khác nhau.
Trong nghiên cứu này, về loại mơ học phù hợp với các kết quả nghiên cứu khác. Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Bằng cũng ghi nhận được: carcinơ xâm lấn dạng NOS chiếm tỷ lệ cao nhất 85,36%. Tương tự, tác giả Âu Nguyệt Diệu cũng nghiên cứu carcinơm xâm lấn dạng NOS chiếm tỷ lệ cao nhất là 88,1%%, kế
tiếp là carcinơm tiểu thùy xâm lấn chiếm tỷ lệ 4,5%, các loại khác cũng chiếm tỷ lệ
thấp. Nghiên cứu của tác giả Lê Đình Roanh và Đồn Thị Phương Thảo cũng ghi nhận được carcinơm xâm lấn dạng NOS cũng chiếm tỷ lệ cao nhất lần lượt là 81,3% và 89%.
Cịn các kết quả nghiên cứu nước ngồi cũng tương tự kết quả của chúng tơi: tác giả Eheman CR, Shaw KM ở Mỹ ghi nhận rằng carcinơm xâm lấn, dạng khơng
Bảng 3.4: So sánh phân bố loại mơ học theo tỷ lệ với các nghiên cứu khác Loại mơ học Nghiên cứu Nghiên cứu này Nguyễn Văn Bằng [1] Lê Đình Roanh [7] Âu Nguyệt Diệu [4] Đồn Thị Phương Thảo [14] CAR.OTV dạng NOS 92,3% 85,36% 81,3% 88,1% 89% CAR. dạng tiểu thùy 2,7% 0,3% 5,8% 0,9% 4% CAR.OTV dạng nhầy 2,3% 1,83% 1,6% 0,5% 1% CAR.OTV dạng nhú 0,7% 0,6% 1,1% 0,9% 2% CAR.OTV dạng chuyển sản 0,7% - - 1,4% - CAR.OTV dạng tủy 0,7% - 0,7% 2,3% - CAR.OTV dạng đỉnh tiết 0,3% - - - - CAR.OTV dạng ống nhỏ 0,3% 0,91% - 0,5% - Các dạng khác - 11% 9,5% 5,4% 4%
3.3 ĐỘ MƠ HỌC
Bảng 3.5: Phân bốđộ mơ học
Biểu đồ 3.3: Phân bố tỷ lệđộ mơ học
Trong nghiên cứu này, độ mơ học cĩ tỷ lệ cao nhất là Grad 2 51,3%, Grad 1 và Grad 3 cũng xấp xỉ nhau, Grad 1 là 24,7%, Grad 3 là 24%.
Bàn luận:
Độ mơ học hay cịn gọi là Grad mơ học, là một tiêu chí để đánh giá đặc điểm và hoạt động của mơ. Ngồi ra, độ mơ học cũng ảnh hưởng đến tiên lượng bệnh, độ
mơ học xấu dần theo thứ tự 1,2,3. Độ mơ học Số trường hợp Grad 1 74 Grad 2 154 Grad 3 72 Tổng cộng 300
Kết quả nghiên cứu của chúng tơi tương tự kết quả của một số nghiên cứu khác về Grad 2 chiếm tỷ lệ cao nhất như: Grad 2 trong nghiên cứu của tác giả Lê
Đình Roanh chiếm 80%, cịn nghiên cứu của tác giả Đặng Cơng Thuận là 70,4%. Theo nghiên cứu của Bloom và Richrdson, Grad 2 cũng chiếm tỷ lệ cao nhất là 45%. Riêng nghiên cứu của Wolf cĩ sự khác biệt, Grad 1, Grad 2 cĩ tỷ lệ bằng nhau là 33%, Grad 3 chiếm 34%. Kết quả nghiên cứu của Elston, độ mơ học chiếm tỷ lệ
cao nhất là Grad 3, 46%. Sự khác biệt này cĩ thể giải thích do sự đa dạng về cỡ
mẫu.
Bảng 3.6: So sánh tỷ lệđộ mơ học với các nghiên cứu
Nghiên cứu Độ mơ học
Grad 1 Grad 2 Grad 3 Nghiên cứu này 24,7% 51,3% 24% Lê Đình Roanh [7] 6,7% 80% 13,3% Đặng Cơng Thuận [15] 13,3% 70,4% 16,3% Bloom, Richardson [21] 26% 45% 29% Wolf et al [78] 33% 33% 34% Elston [34] 17% 37% 46% 3.4 TÌNH TRẠNG DI CĂN HẠCH Bảng 3.7: Tình trạng di căn hạch Số hạch di căn Số trường hợp Khơng cĩ hạch di căn 207 1 – 3 hạch 53 > 3 hạch 40 Tổng cộng 300
Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ di căn hạch
Kết quả tình trạng di căn hạch trong nghiên cứu này cho thấy tình trạng khơng di căn hạch chiếm tỷ lệ cao nhất là 69%, kếđến là di căn 1-3 hạch chiếm 17,7%, sau cùng là di căn > 3 hạch chiếm tỷ lệ thấp nhất là 13,3%.
Bàn luận:
Nhưđã biết, ung thư vú là loại ung thư dễ cĩ khuynh hướng di căn hạch. Tình trạng di căn hạch là dấu hiệu tiên lượng xấu, số hạch di căn càng nhiều thì diễn tiến bệnh càng xấu và khả năng bị di căn xa càng cao. 3.5 SỰ BIỂU HIỆN CỦA THỤ THỂ ESTROGEN, PROGESTERONE Bảng 3.8: Sự biểu hiện của thụ thể estrogen, progesterone Kết quả ER, PR Số trường hợp ER(+)PR(+) 146 ER(+)PR(-) 31 ER(-)PR(+) 9 ER(-)PR(-) 114 Tổng cộng 300
Biểu đồ 3.5: Tỷ lệ biểu hiện của ER, PR
Theo Biểu đồ 3.5, nhận thấy rằng sự biểu hiện của thụ thể ER, PR cùng dương tính chiếm tỷ lệ cao nhất là 48,7%, đứng hàng thứ hai là sự biểu hiện của thụ thể
ER, PR cùng âm tính là 38%, kế đĩ là ER(+)PR(-) dương tính chiếm 10,3%, thấp nhất là sự biểu hiện của thụ thể ER (-) PR(+) âm tính, 3%.
Bàn luận:
Đối với ung thư vú, ngồi nồng độ estrogen nội sinh tăng cao cần thiết phải cĩ sự tăng biểu hiện thụ thể ER trong tế bào ung thưđể gắn kết với estrogen, phức hợp estrogen - thụ thể sẽ khởi động cơ chế hoạt hĩa một số gen đặc hiệu trong nhân. PR là một protein, được tổng hợp theo điều hịa thuận chiều của ER. PR là yếu tố bổ sung quan trọng bên cạnh ER.
Thụ thể ER và thụ thể PR vừa cĩ vai trị quan trọng trong giá trị tiên lượng bệnh và giá trị tiên đốn đáp ứng với điều trị nội tiết. Trường hợp cĩ kết quả biểu hiện ER(+) PR(+) cĩ giá trị tiên lượng tốt, đáp ứng tốt với tamoxifen và các thuốc nội tiết khác, giúp bệnh nhân cĩ thời gian sống dài hơn.
Trường hợp cĩ kết quả ER(-) PR(+) cĩ thể là do ER(-) giả hay PR được biểu hiện theo cơ chế khác, độc lập với sự điều hịa của ER. Tuy nhiên, những trường hợp như thế vẫn cĩ tỷ lệđáp ứng với tamoxifen.
Trường hợp sự biểu hiện của thụ thể ER, PR đều (-) cĩ giá trị tiên lượng kém, khơng đáp ứng tốt với liệu pháp nội tiết.
Kết quả của nghiên cứu này khá phù hợp với kết quả của các nghiên cứu khác như kết quả của tác giả Trần Hịa và cộng sự, Lê Quốc Sử và cộng sự, Lê Đình Roanh và cộng sự. Bảng 3.9: So sánh sự biểu hiện của thụ thể ER và PR với các nghiên cứu Kết quả Nghiên cứu Nghiên cứu này Trần Hịa và cs [5] Lê Quốc Sử và cs [9] Lê Đình Roan và cs [6] ER(+)PR(+) 48,7% 40,2% 35% 53,3% ER(+)PR(-) 10,3% 8,5% 14% 7,8% ER(-)PR(+) 3% 11,1% 11% 8,5% ER(-)PR(-) 38% 40,2% 40% 30,3% 3.6 SỰ BIỂU HIỆN CỦA THỤ THỂ HER2/IHC Bảng 3.10: Sự biểu hiện của thụ thể HER2 Kết quả HER2 Số trường hợp 0 54 1 53 2 112 3 81 Tổng cộng 300
Biểu đồ 3.6: Tỷ lệ sự biểu hiện của thụ thể HER2
Dựa vào Biểu đồ 3.6, sự biểu hiện của thụ thể HER2 được đánh giá 0 và 1+ cĩ nghĩa là HER2 âm tính hay nĩi cách khác là khơng biểu hiện quá mức đều chiếm tỷ