Estrogen và progesterone tác động lên sự tăng trưởng của u vú. Mục tiêu của liệu pháp nội tiết là tác động vào đường dẫn thụ thể estrogen để khĩa tác dụng của estrogen hoặc làm giảm nồng độ của estrogen. Liệu pháp nội tiết được chia làm 2 nhĩm chính:
– Nhĩm 1: sử dụng các chất kháng estrogen như tamoxifen, fulvestrant, raloxifen. Nhĩm này dùng các chất kháng estrogen gắn dính vào các thụ thể
estrogen và khĩa các thụ thể này lại. Nhĩm này được chỉ định cho phụ nữ tiền mãn kinh.
– Nhĩm 2: làm giảm sự sản xuất estrogen. Nhĩm này hiện cĩ các thuốc Goserlin, các thuốc kháng aromataz. Nhĩm này được chỉ định cho phụ nữ sau mãn kinh [89].
Cĩ nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi gen HER2 khuếch đại, bệnh nhân sẽ đáp ứng kém với tamoxifen. Năm 2003, sau 20 năm nghiên cứu của thử nghiệm Naples Gun cũng đã tìm ra được kết luận như thế.
1.2.4.2 HER2 và hĩa trị liệu
Các phương cách điều trị ung thư vú được thực hiện bằng thuốc hĩa học gây
độc tế bào (cytotoxic drug). Một số thuốc hĩa trị thường được dùng phổ biến như: Anthracyclines ( Doxorubicin, Epirubicin), Taxanes (Paclitaxel, Docetaxel), nhĩm Alkyl hĩa (Cyclophosphamide…), nhĩm chống chuyển hĩa (5 Fluorouracil, Methotrexate). Những nhĩm thuốc kể trên cĩ thể được chỉ định dùng riêng lẻ hay cũng cĩ thể dùng kết hợp với trị liệu khác để cĩ hiệu quả hơn.
Hĩa trị là một phương cách điều trị hệ thống và cĩ thể gây ra tác dụng phụ. Do
đĩ, chỉ định phương cách trị liệu này cho bệnh nhân chỉ khi cần thiết. Một vài nghiên cứu ghi nhận những trường hợp ung thư vú cĩ biểu hiện quá mức protein HER2 thì nhạy với điều trị paclitaxel, cũng như phác đồ điều trị cĩ anthracyline.
Điều này được giải thích là do anthracyline là một chất ức chế men topoisomerase, trong khi đĩ men topoisomerase IIα thường được đồng khuếch đại cùng HER2. Topoisomerase IIα là một enzyme, được tìm thấy trong nhân của tế bào động vật cĩ vú, điều chỉnh những thay đổi cấu trúc khơng gian của DNA bằng cách làm gãy cầu nối protein DNA ở cả hai mạch [71]
1.2.4.3 HER2 và trị liệu nhắm trúng đích
Liệu pháp nhắm trúng đích là dùng các loại thuốc để khĩa sự tăng trưởng và lan tràn của ung thư. Chúng can thiệp vào các phân tử đặc hiệu trong cơ chế sinh ung và sự tăng trưởng của khối bướu. Vì các nhà nghiên cứu gọi các phân tử này là “các đích phân tử” nên liệu pháp này được gọi là liệu pháp nhắm trúng đích phân tử
hay liệu pháp trúng đích. Liệu pháp này được dùng riêng lẻ hay kết hợp với các liệu pháp khác.
Liệu pháp nhắm trúng đích can thiệp vào sự tăng trưởng và sự nhân đơi của tế bào ung thư theo nhiều đường khác nhau cũng như tại những điểm thay đổi trong suốt quá trình hình thành tăng trưởng và lan tràn của ung thư. Nhiều loại liệu pháp
trúng đích nhắm vào các protein cĩ liên hệ tới quá trình dẫn truyền tín hiệu. Khi khĩa các tín hiệu, các tế bào ung thư tăng trưởng và sinh sơi vơ tổ chức, liệu pháp này làm ngừng sự tăng trưởng và nhân đơi của các tế bào ung thư. Các đích phân tử
khác là sự biểu hiện gen, sự sinh mạch, sự chết tế bào.
Khi HER2 khuếch đại và biểu hiện quá mức chiếm tỷ lệ cao trong ung thư vú làm cho HER2 trở thành mục tiêu hấp dẫn để phát triển phương cách trị liệu. Năm 1998, Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (gọi tắt là FDA) đã cơng nhận trastuzumab là liệu pháp nhắm trúng đích đầu tiên được dùng điều trị ung thư vú di căn. Kết quả cho thấy trastuzumab làm bệnh tiến triển chậm hơn, tăng tỉ lệ và thời gian đáp ứng với điều trị hổ trợ, tăng thời gian sống cho bệnh nhân.
Hình 1.9: Vai trị của kháng thểđơn dịng trong trị liệu nhắm trúng đích [94] Trastuzumab (thuốc cĩ tên là Herceptin) là một loại kháng thể đơn dịng gắn kết vào yếu tố tăng trưởng HER2 làm ngăn chặn hoạt động của yếu tố này. Yếu tố
tăng trưởng HER2 cĩ trên bề mặt của tế bào ung thư vú, cĩ tác động làm tế bào ung thư vú sinh sản. Herceptin làm chậm lại hay dừng sự tăng trưởng của các tế bào này. Herceptin chỉ được dùng để điều trị các loại ung thư vú biểu hiện quá mức
protein HER2 hay HER2 khuếch đại. Herceptin được dùng riêng lẻ hay kết hợp với hĩa trị [26], [31], [55], [71], [76], [80], [86].
1.3 PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM HER2
Việc xác định chính xác tình trạng của HER2 cĩ vai trị quan trọng trong việc tiên lượng và dựđốn và cũng là một gợi ý cho việc lựa chọn phương cách điều trị
thích hợp cho bệnh nhân ung thư vú. Cĩ nhiều phương pháp xác định tình trạng HER2 nhưng hiện nay thường áp dụng hai phương pháp sau: Phương pháp bán định lượng – sử dụng kỹ thuật Hĩa mơ Miễn dịch (IHC- Immunohistochemistry) đểđánh giá thụ thể HER2 - sản phẩm protein của gen HER2 trên bề mặt tế bào; Phương pháp định lượng đánh giá sự khuếch đại gen HER2 là kỹ thuật Lai tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH- Fluorescence in situ hybridization). Trong đĩ, FISH được đánh giá là tiêu chuẩn vàng để xác định sự biểu hiện của gen HER2 trong ung thư vú.
1.3.1 Hĩa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry – IHC) [22], [30] 1.3.1.1 Lịch sử phát triển 1.3.1.1 Lịch sử phát triển
Năm 1941, Coons và cộng là những người đầu tiên đánh dấu kháng thể bằng chất nhuộm huỳnh quang và dùng chúng để xác định vị trí kháng nguyên trên mặt cắt mơ. Kỹ thuật này ngày càng phát triển, một số enzyme đã được dùng để đánh dấu kháng thể như peroxidase (Nakane và Pierce, 1966) và alkaline phosphatase (Mason và Sammon, 1978). Keo vàng được phát hiện bởi Faulk và Taylor (1971) cĩ thể sử dụng để phát hiện phản ứng hĩa mơ miễn dịch bằng cả kính hiển vi quang học lẫn kính hiển vi điện tử. Những chất đánh dấu khác bao gồm những phân tử
phĩng xạ và phản ứng miễn dịch được nhận biết bằng phĩng xạ tự ghi. Ngày nay, hĩa mơ miễn dịch đã trở thành một kỹ thuật chủ yếu và được áp dụng rộng rãi trong nhiều phịng thí nghiệm, đặc biệt là trong y học (chẩn đốn lâm sàng).
1.3.1.2 Nguyên tắc
Hĩa mơ miễn dịch là phương pháp định vị kháng nguyên trên mặt cắt của mơ bằng cách sử dụng kháng thể đã được đánh dấu như là thuốc thửđặc hiệu. Nếu cĩ hiện diện kháng nguyên trên mơ (bào tương, màng tế bào, nhân) sẽ cĩ phản ứng
kháng nguyên – kháng thể xảy ra. Sau đĩ đem gắn với hệ thống phĩng đại nhận biết và gắn màu để cĩ thể lưu trữ lâu và quan sát dưới kính hiển vi quang học.
1.3.1.3 Kháng nguyên
Bản chất hĩa học của kháng nguyên thường là các protein, một số khác là carbohydrate. Kháng thể phản ứng với một phần (kháng thể đơn dịng) hay nhiều phần (kháng thể đa dịng) của kháng nguyên tại các vị trí được gọi là “vị trí tiếp xúc” (epitope). Một kháng nguyên thường cĩ nhiều vị trí tiếp xúc tiềm tàng, do đĩ cần được bộc lộ trước khi cho tiếp xúc với kháng thể.
1.3.1.4 Kháng thể
Theo Boenish và cộng sự, năm 2002, kháng thể thuộc nhĩm protein gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin – Ig). Globulin miễn dịch gồm 5 nhĩm chính,
được xếp theo thứ tự giảm dần trong huyết thanh: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE. Trong đĩ IgG và IgM thường được dùng trong hĩa mơ miễn dịch. Kháng thể tiếp xúc với kháng nguyên được gọi là kháng thể thứ nhất. Tùy theo cách sản xuất cĩ 2 loại kháng thể: kháng thểđa dịng và kháng thểđơn dịng.
A B
Hình 1.10: Kháng thểđa dịng và kháng thểđơn dịng
B: Kháng thểđơn dịng phản ứng với một epitope đặc hiệu trên kháng nguyên
Kháng thể đa dịng (polyclonal antibodies): được tạo ra bằng cách gây miễn dịch ở động vật với kháng nguyên đặc hiệu. Động vật đáp ứng miễn dịch và tạo ra kháng huyết thanh bao gồm nhiều loại kháng thể đặc hiệu và khơng đặc hiệu. Kháng thểđa dịng dễ sản xuất và nhạy hơn kháng thểđơn dịng. Tuy nhiên, kháng thể đa dịng cĩ nhược điểm là ngay cả sau khi tinh sạch, kháng thể đa dịng vẫn cĩ thể chứa những kháng thể phản ứng khơng đặc hiệu với các kháng nguyên; và cĩ khuynh hướng nhuộm nền cao.
Kháng thểđơn dịng (monoclonal antibody): được sản xuất bằng kỹ thuật u lai. Phương pháp này phối hợp khả năng tạo kháng thể đặc hiệu từ tương bào với lympho bào B ở lách động vật được gây miễn dịch, hình thành nhiều dịng tế bào u lai sản xuất ra kháng thểđặc hiệu. Ưu điểm của kháng thểđơn dịng là độđồng nhất rất cao, rất tinh khiết và đặc hiệu.
Cĩ nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kháng thể như: độ pha lỗng kháng thể, nhiệt
độ ủ, và thời gian ủ.
1.3.1.5 Hệ thống nhận biết
Do phức hợp kháng nguyên – kháng thể khơng thể thấy được dưới kính hiển vi quang học nên cần một hệ thống để hiển thị vị trí cĩ phản ứng kháng nguyên – kháng thể. Hệ thống này gồm 2 phần: kháng thể thứ hai hay kháng thể bắt cầu và hệ
thống phĩng đại dấu hiệu nhận biết.
Kháng thể thứ hai là cầu nối kháng thể thứ nhất với hệ thống phĩng đại dấu hiệu nhận biết, đĩ là kháng thể chống globulin miễn dịch (Ig) của kháng thể thứ
nhất.
Hệ thống phĩng đại dấu hiệu nhận biết gồm một men (enzyme), chất nền (subtrate) và chất màu (chromogen).
Cĩ nhiều phương pháp nhuộm cĩ thể dùng để định vị kháng nguyên. Do đĩ việc lựa chọn phương pháp thích hợp cần dựa trên các thơng số như loại mẫu vật và
độ nhạy yêu cầu.
a. Trực tiếp (direct method)
Hình 1.11 : Phương pháp trực tiếp
Đây là phương pháp cổ điển nhất. Một kháng thể sơ cấp được đánh dấu enzyme phản ứng với kháng nguyên trên mơ, sau đĩ sử dụng cơ chất tạo màu để
phát hiện phản ứng khơng đặc hiệu. Phương pháp này đơn giản, nhanh, cĩ tính đặc hiệu nhưng ít nhạy cảm do thiếu hệ thống phĩng đại dấu hiệu nhận biết nên khơng thểđáp ứng được nhu cầu ngày nay.
b. Gián tiếp hai bước (two – step indirect method)
Hình 1.12: Phương pháp gián tiếp hai bước
Phương pháp này bước đầu cho kháng thể sơ cấp kết hợp với kháng nguyên, sau đĩ bổ sung một kháng thể thứ cấp đánh dấu enzyme kháng lại kháng thể sơ cấp
Enzyme Kháng thể 1 Kháng nguyên Enzyme Kháng thể 2 Kháng nguyên Kháng thể 1
(bây giờ là kháng nguyên), và cuối cùng bổ sung cơ chất tạo màu. Phương pháp này linh hoạt hơn phương pháp trực tiếp vì nhiều loại kháng thể sơ cấp khác nhau từ
cùng một lồi cĩ thể sử dụng với cùng kháng thể thứ cấp cộng hợp. Phương pháp này cũng nhạy hơn phương pháp nhuộm trực tiếp vì nhiều kháng thể thứ cấp sẽ
phản ứng với nhiều epitope khác nhau trên kháng thể sơ cấp và khuếch đại tín hiệu lên nhiều lần nhờ cĩ nhiều enzyme được cốđịnh trên mỗi vị trí đích. Thơng thường kháng thể sơ cấp là kháng thểđơn dịng và kháng thể thứ cấp là kháng thểđa dịng.
c. Gián tiếp ba bước (three-step indirect method)
Hình 1.13: Phương pháp gián tiếp ba bước
Phương pháp này được bổ sung thêm một kháng thểđánh dấu enzyme nữa vào phương pháp gián tiếp hai bước. Hai kháng thể thứ cấp được bố trí theo thứ tựnhư
Hình 1.13. Phương pháp này đặc biệt hữu dụng khi nhuộm những kháng nguyên cĩ ít epitone.
Kháng nguyên Enzyme
Kháng thể 2
d. Phức hợp miễn dịch enzyme tan:
Hình 1.14: Phức hợp miễn dịch enzyme tan
Phương pháp nhuộm này cần cĩ kháng thể sơ cấp, phức hợp miễn dịch hịa tan enzyme – kháng thể kháng enzyme và dung dịch cơ chất. Phức hợp miễn dịch
được tạo ra bằng cách cho enzyme phản ứng với kháng thể của nĩ, loại bỏ kết tủa, thu dịch hịa tan. Kháng thể sơ cấp và kháng thể của enzyme phải tạo ra từ cùng một lồi. Kháng thể thứ cấp phải trực tiếp kháng lại globulin miễn dịch của lồi đĩ. Trước tiên cho kháng thể sơ cấp và phức hợp enzyme – kháng thể kháng enzyme phản ứng với kháng nguyên, sau đĩ bổ sung kháng thể thứ cấp. Kháng thể thứ cấp phải được bổ sung với một lượng thừa để một vị trí Fab sẽ gắn với kháng thể sơ
cấp, vị trí cịn lại gắn với kháng thể trong phức hợp miễn dịch của enzyme. Kháng thể 3 Kháng thể 1 Kháng thể 2 Kháng nguyên Enzyme
e. Phương pháp (strept)avidin-biotin
Hình 1.15a: ABC Hình 1.15b: LAB hay LSAB Hình 1.15: Phương pháp (strept)avidin-biotin
Phần lớn những phương pháp nhuộm ngày nay đều dựa trên ái lực lớn giữa (strept)avidin (Streptomyces avidinii) và avidin (trứng gà) với biotin. Phương pháp này cĩ độ nhạy và khả năng khuếch đại rất cao. Thành phần cơ bản gồm kháng thể
sơ cấp kháng kháng nguyên, kháng thể thứ cấp cĩ gắn biotin kháng kháng thể sơ
cấp, phức hợp enzyme – (strept)avidin-biotin (ABC) hay streptavidin cĩ đánh dấu enzyme (LSAB), và cuối cùng là dung dịch cơ chất. Enzyme đánh dấu thường được sử dụng nhất là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase. Phương pháp LSAB nhạy hơn ABC. Để đáp ứng mục tiêu của đề tài này, chúng tơi sử dụng phương pháp LSAB với kháng thể thứ cấp gắn biotin, phức hợp streptavidin- biotinylated horseradish peroxidase và cơ chất 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) để đánh giá sự biểu hiện của protein HER2.
1.3.2 Lai tại chỗ gắn huỳnh quang (Fluorescent in situ hybridization - FISH) 1.3.2.1 Lịch sử phát triển [46] 1.3.2.1 Lịch sử phát triển [46]
Kỹ thuật lai tại chỗ lần đầu tiên được cơng bố vào những năm cuối của thập niên 60 và đầu những năm thập niên 70. Thử nghiệm lúc đầu được thực hiện bằng
đoạn dị phĩng xạ DNA. Nhưng đoạn dị phĩng xạ lại cĩ nhiều nhược điểm như
Enzyme (Strept)avidin Biotin Kháng thể 2 Kháng thể 1 Kháng nguyên
khơng bảo quản lâu, khơng an tồn cho con người, cần phải vận chuyển, xử lý, lưu trữ theo quy định. Vì những nhược điểm trên, các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát triển kỹ thuật mới thay thế cho kỹ thuật cũ dùng mẫu dị phĩng xạ.
Kỹ thuật FISH được ứng dụng lần đầu tiên vào năm 1980. Kỹ thuật này dùng
đoạn dị biotinylated-DNA và kháng thể đánh dấu huỳnh quang. Năm 1991, việc dùng DNA gắn chất huỳnh quang trong lai tại chỗ nhanh và dễ dàng hơn, đánh dấu thời kỳ của FISH.
1.3.2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật FISH
FISH là kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào và di truyền phân tử. FISH sử
dụng một đoạn dị đặc hiệu gắn tín hiệu huỳnh quang, để phát hiện sự cĩ mặt hoặc vắng mặt của một đoạn gen nào đĩ trên nhiễm sắc thể. Các đoạn dị DNA cĩ đánh dấu huỳnh quang được lai gắn lên các vị trí tương ứng trên nhiễm sắc thể muốn tìm hiểu. Sau lai, sản phẩm được khảo sát dưới kính hiển vi huỳnh quang để tìm tín hiệu của các đoạn dị được lai.
1.3.2.3 Đoạn dị
Đoạn dị thu được từ những đoạn cắt của DNA, sau đĩ được tinh chế và khuếch đại để dùng trong dự án bộ gen người. Do kích thước bộ gen người rất lớn nên cần phải phân chia bộ gen thành từng đoạn nhỏ. Đoạn dị cơ bản dùng trong kỹ
thuật FISH cĩ khoảng 100.000 cặp base.
1.3.2.4 Sự biểu hiện của các gen trong kỹ thuật FISH
DNA-acid deoxyribonucleic, là một phân tử sinh học đơn giản, cĩ vai trị quan trọng trong cuộc sống. DNA nằm trong nhân chứa thiết kế của tất cả các cấu trúc và hoạt động của tế bào. DNA gồm 4 loại nucleotide: adenine (A), guanine (G), cytosine (C), và thymine (T). DNA gồm 2 chuỗi đối song song, cùng uốn quanh một trục trung tâm theo chiều xoắn phải. DNA nhân đơi, tổng hợp 3 loại RNA: RNA ribosom (rRNA), RNA thơng tin (mRNA), RNA vận chuyển. Chuỗi đơi DNA gắn kết với nhau bằng liên kết hydro theo “nguyên tắc bổ sung”: A-T, C-G. Tuy nhiên, liên kết hydro là liên kết yếu, khơng bền vững, nên dễ dàng bị phá hủy hồn tồn, chuỗi đơi DNA bị tách ra thành hai sợi đơn. Hiện tượng này được gọi là biến
tính. Sau đĩ hai chuỗi đơn cĩ thể gắn kết lại với nhau hoặc với một chuỗi đơn tương hợp khác. Các cặp base này lai với nhau rất chính xác, chặt chẽ. Do đĩ, ta cĩ thể gọi các chuỗi acid nucleic mẫu là đoạn dị (đã biết trình tự acid nucleic). Đoạn dị này cĩ thể lai với hỗn hợp acid nucleic tạo ra chuỗi acid nucleic, hoặc những đoạn gen tương hợp trên các chuỗi DNA, RNA.
Hình 1.16: Nguyên tắc của FISH
1.3.2.5 Ứng dụng của kỹ thuật FISH
Kỹ thuật FISH được ứng dụng rộng rãi trong những trường hợp sau: