1.2.1 Giới thiệu gia đình HER [80]
Protein HER cĩ bản chất là thụ thể của yếu tố tăng trưởng thượng bì. Ở người, gia đình HER bao gồm 4 thụ thể xuyên màng cĩ liên quan mật thiết với nhau, và tương tác với nhau theo nhiều cách, gồm cĩ HER1 (cịn gọi là “thụ thể của yếu tố
tăng trưởng thượng bì”, viết tắt là EGFR hay Erb-B1); HER2 hay Erb-B2; HER3 hay Erb-B3 và HER4. Các thụ thể xuyên màng HER đĩng vai trị quan trọng trong mạng lưới tín hiệu điều khiển quá trình phát triển và biệt hĩa của tế bào. Ở tế bào bình thường, hoạt tính của chúng được điều hịa chặt chẽ, đáng kể nhất qua thụ thể
Her2. Thụ thể HER là glycoprotein được mã hĩa bởi các gen tiền ung thư nằm ở
nhiễm sắc thể 7 (Her1); 17 (Her2); 12 (Her3); 2 (Her4).
Mỗi một thụ thể trong gia đình HER cĩ hình thái giống nhau. Các thụ thể của gia đình HER nằm ở màng tế bào, gồm 3 miền:
– Miền ngoại bào cĩ “vị trí kết nối với ligand”(trừ HER2), là nơi thụ thể
gắn với ligand và “vị trí bắt cặp”, nơi kết hợp với các thụ thể Her khác, cùng loại hay khác loại.
– Miền xuyên màng cĩ thành phần ưa lipit.
– Miền nội bào hay cịn gọi là miền hoạt động của các tyrosine kinase (ngoại trừ HER3 thiếu tyrosine kinase bên trong), hoạt hĩa các dịng thác truyền tín hiệu [36], [37], [54], [58], [64], [79], [80].
Hình 1.4: Các thụ thể trong gia đình HER (hình mượn từ CD ROM. HER1/EGFR dysregulation and inhibition in NSCLC and Other Solid Tumors. Copyright © 2007 by Genentech, Inc. All rights reserved LM0104-M00775-R0- 05/04)
1.2.2 Giới thiệu HER2 trong ung thư vú
Hình 1.6: Vai trị protein HER2 [80]
HER2 và Erb-B2 là những gen của người được phát hiện nhờ một yếu tố
tương đồng của chúng với gen retrovirus v-erb-B2. Những nghiên cứu về bản đồ bộ
gen của nhiễm sắc thể sau này đã được xác định HER2 và Erb-B2 là cùng một gen. HER2 là một tiền gen sinh ung, nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể 17, tại vị trí 21, ký hiệu là 17q21. Sản phẩm của gen HER2 là một loại glycoprotein xuyên màng, cĩ trọng lượng phân tử là 185kd. Protein HER2 là thụ thể các yếu tố dẫn truyền tín hiệu tăng trưởng quyết định sự phân chia trưởng thành của tế bào.
Trong ung thư vú xâm lấn, gen HER2 khuếch đại chiếm khoảng 20-30%. Gen Her2 khuếch đại gây gia tăng số lượng thụ thể HER2, gia tăng truyền tín hiệu làm tăng phân bào, giảm chết theo lập trình, giúp khối u phát triển.
Miền ngoại bào của các thụ thể Her được kết nối với một protein bên ngồi tế
bào, gọi là ligand. Mỗi thụ thể trong họ HER cĩ thể cĩ nhiều ligand đặc hiệu gắn vào như HER1, HER3, HER4. Riêng HER2 khơng cĩ ligand nào gắn vào. Khi các thụ thể HER gắn kết với ligand làm hình thái thay đổi từ trạng thái đĩng sang mở, các thụ thể trong họ HER kết hợp với một thụ thể HER khác, được gọi là “sự bắt cặp”, lúc này dịng thác truyền tín hiệu bắt đầu hoạt hĩa. Sự bắt cặp cĩ thể xảy ra
giữa các thành viên trong họ HER hoặc cĩ thể tự bắt cặp với nhau. Trong khi đĩ, HER2 thì luơn ở trạng thái mở vì khơng gắn kết với ligand nên liên tục cĩ sự bắt cặp. Sau khi bắt cặp, các thụ thểở gần nhau hơn và cĩ thể kích hoạt lẫn nhau, miền tyrosine nội bào của hai thụ thể sẽđược kích thích nhờ sự phosphoryl hĩa lẫn nhau, sẽ thúc đẩy dịng thác tín hiệu tế bào, gây nhiều tác động trên tế bào:
Đường tín hiệu PI3K thúc đẩy chu trình phân bào và ngăn tế bào chết theo lập trình.
Đường tín hiệu Ras/Raf/MEK/MAPK kinase làm gia tăng sự phát triển của tế bào u.
Đường tín hiệu STAT3 gây ra sự sao chép gen.
Đường tín hiệu FAK kích thích tế bào u xâm nhập.
Các tác động khác gồm: sinh mạch máu, xâm nhập và di căn.
Với 4 thành viên trong họ HER, mỗi thành viên cĩ thể tự bắt cặp hay bắt cặp với thành viên khác trong họ HER. Trong các đơi bắt cặp đĩ, cặp HER2 : HER3 là một cặp tín hiệu trong các kiểu tiền lâm sàng của ung thư vú HER2 dương tính.
Trong tế bào, các thụ thể truyền tín hiệu từ ngồi vào trong. Các tín hiệu này cĩ nhiều tác động như phát triển, tăng trưởng và tồn tại. Hoạt động của thụ thể và tín hiệu tế bào được cân bằng trong tế bào bình thường. Khi đường truyền tín hiệu bị mất kiểm sốt, cĩ thể làm tăng tín hiệu, thụ thể HER sẽ biểu hiện quá mức, do đĩ sẽ làm các tế bào ung thư phát triển và lan rộng [24], [36], [38], [47], [65], [66], [69], [71], [72], [75], [80], [86].
Hình 1.7: Các cặp đơi cĩ HER2 cho nhiều tín hiệu tế bào [94]
Hình 1.8: Thụ thể HER2 cĩ thể bắt cặp với tất cả các thụ thể HER khác để khởi
động các dịng thác truyền tín hiệu. Vai trị của HER2 trong ung thư vú [94] (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1.2.3 Giá trị tiên lượng của HER2 [71]
Năm 1987, Slamon cùng đồng sựđã xác định sự khuếch đại của gen HER2 cĩ giá trị tiên lượng trong ung thư vú ở người. HER2 cĩ giá trị tiên lượng cao, kể từ
khi sự khuếch đại của gen này tương quan với sự tăng trưởng, phát triển, xâm nhập, tăng sinh mạch và giảm chết theo lập trình. Sự khuếch đại của HER2 cũng dựđốn
được thời gian tồn tại và thời gian tái phát bệnh của bệnh nhân ung thư vú.
HER2 khuếch đại hay biểu hiện quá mức cho thấy bệnh nhân cĩ dựđốn kết quả lâm sàng xấu [50]. Trường hợp bệnh nhân cĩ kết quả âm tính , giá trị dựđốn của HER2 vẫn cịn gây nhiều tranh cãi. Một vài nghiên cứu cho thấy giá trị dựđốn gây bất lợi trong trường hợp bệnh nhân cĩ kết quả âm tính. Nhưng cũng cĩ nghiên cứu cho thấy sự tương quan giữa kết quả HER2 và kết quả lâm sàng khơng cĩ ý nghĩa. Sự khác nhau này cĩ thể do vơ số nhân tố như số lượng bệnh nhân, thời gian theo dõi bệnh, kỹ thuật xác định và giải thích tình trạng HER2 là quan trọng nhất. Năm 2007, việc đánh giá tình trạng HER2 trong tất cả trường hợp ung thư vú xâm lấn, bất kể bệnh mới hay tái phát, đã được Mạng Lưới Ung Thư Quốc Gia (National Comprehensive Cancer Network (NCCN)) và Hiệp hội Ung thư Lâm sàng Hoa Kỳ
(American Society of Clinical Oncology (ASCO)) chấp nhận [78].
1.2.4 Giá trị tiên đốn của HER2 1.2.4.1 HER2 và liệu pháp nội tiết 1.2.4.1 HER2 và liệu pháp nội tiết
Estrogen và progesterone tác động lên sự tăng trưởng của u vú. Mục tiêu của liệu pháp nội tiết là tác động vào đường dẫn thụ thể estrogen để khĩa tác dụng của estrogen hoặc làm giảm nồng độ của estrogen. Liệu pháp nội tiết được chia làm 2 nhĩm chính:
– Nhĩm 1: sử dụng các chất kháng estrogen như tamoxifen, fulvestrant, raloxifen. Nhĩm này dùng các chất kháng estrogen gắn dính vào các thụ thể
estrogen và khĩa các thụ thể này lại. Nhĩm này được chỉ định cho phụ nữ tiền mãn kinh.
– Nhĩm 2: làm giảm sự sản xuất estrogen. Nhĩm này hiện cĩ các thuốc Goserlin, các thuốc kháng aromataz. Nhĩm này được chỉ định cho phụ nữ sau mãn kinh [89].
Cĩ nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi gen HER2 khuếch đại, bệnh nhân sẽ đáp ứng kém với tamoxifen. Năm 2003, sau 20 năm nghiên cứu của thử nghiệm Naples Gun cũng đã tìm ra được kết luận như thế.
1.2.4.2 HER2 và hĩa trị liệu
Các phương cách điều trị ung thư vú được thực hiện bằng thuốc hĩa học gây
độc tế bào (cytotoxic drug). Một số thuốc hĩa trị thường được dùng phổ biến như: Anthracyclines ( Doxorubicin, Epirubicin), Taxanes (Paclitaxel, Docetaxel), nhĩm Alkyl hĩa (Cyclophosphamide…), nhĩm chống chuyển hĩa (5 Fluorouracil, Methotrexate). Những nhĩm thuốc kể trên cĩ thể được chỉ định dùng riêng lẻ hay cũng cĩ thể dùng kết hợp với trị liệu khác để cĩ hiệu quả hơn.
Hĩa trị là một phương cách điều trị hệ thống và cĩ thể gây ra tác dụng phụ. Do
đĩ, chỉ định phương cách trị liệu này cho bệnh nhân chỉ khi cần thiết. Một vài nghiên cứu ghi nhận những trường hợp ung thư vú cĩ biểu hiện quá mức protein HER2 thì nhạy với điều trị paclitaxel, cũng như phác đồ điều trị cĩ anthracyline.
Điều này được giải thích là do anthracyline là một chất ức chế men topoisomerase, trong khi đĩ men topoisomerase IIα thường được đồng khuếch đại cùng HER2. Topoisomerase IIα là một enzyme, được tìm thấy trong nhân của tế bào động vật cĩ vú, điều chỉnh những thay đổi cấu trúc khơng gian của DNA bằng cách làm gãy cầu nối protein DNA ở cả hai mạch [71]
1.2.4.3 HER2 và trị liệu nhắm trúng đích
Liệu pháp nhắm trúng đích là dùng các loại thuốc để khĩa sự tăng trưởng và lan tràn của ung thư. Chúng can thiệp vào các phân tử đặc hiệu trong cơ chế sinh ung và sự tăng trưởng của khối bướu. Vì các nhà nghiên cứu gọi các phân tử này là “các đích phân tử” nên liệu pháp này được gọi là liệu pháp nhắm trúng đích phân tử
hay liệu pháp trúng đích. Liệu pháp này được dùng riêng lẻ hay kết hợp với các liệu pháp khác.
Liệu pháp nhắm trúng đích can thiệp vào sự tăng trưởng và sự nhân đơi của tế bào ung thư theo nhiều đường khác nhau cũng như tại những điểm thay đổi trong suốt quá trình hình thành tăng trưởng và lan tràn của ung thư. Nhiều loại liệu pháp
trúng đích nhắm vào các protein cĩ liên hệ tới quá trình dẫn truyền tín hiệu. Khi khĩa các tín hiệu, các tế bào ung thư tăng trưởng và sinh sơi vơ tổ chức, liệu pháp này làm ngừng sự tăng trưởng và nhân đơi của các tế bào ung thư. Các đích phân tử
khác là sự biểu hiện gen, sự sinh mạch, sự chết tế bào.
Khi HER2 khuếch đại và biểu hiện quá mức chiếm tỷ lệ cao trong ung thư vú làm cho HER2 trở thành mục tiêu hấp dẫn để phát triển phương cách trị liệu. Năm 1998, Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (gọi tắt là FDA) đã cơng nhận trastuzumab là liệu pháp nhắm trúng đích đầu tiên được dùng điều trị ung thư vú di căn. Kết quả cho thấy trastuzumab làm bệnh tiến triển chậm hơn, tăng tỉ lệ và thời gian đáp ứng với điều trị hổ trợ, tăng thời gian sống cho bệnh nhân.
Hình 1.9: Vai trị của kháng thểđơn dịng trong trị liệu nhắm trúng đích [94] Trastuzumab (thuốc cĩ tên là Herceptin) là một loại kháng thể đơn dịng gắn kết vào yếu tố tăng trưởng HER2 làm ngăn chặn hoạt động của yếu tố này. Yếu tố
tăng trưởng HER2 cĩ trên bề mặt của tế bào ung thư vú, cĩ tác động làm tế bào ung thư vú sinh sản. Herceptin làm chậm lại hay dừng sự tăng trưởng của các tế bào này. Herceptin chỉ được dùng để điều trị các loại ung thư vú biểu hiện quá mức
protein HER2 hay HER2 khuếch đại. Herceptin được dùng riêng lẻ hay kết hợp với hĩa trị [26], [31], [55], [71], [76], [80], [86].
1.3 PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM HER2
Việc xác định chính xác tình trạng của HER2 cĩ vai trị quan trọng trong việc tiên lượng và dựđốn và cũng là một gợi ý cho việc lựa chọn phương cách điều trị (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thích hợp cho bệnh nhân ung thư vú. Cĩ nhiều phương pháp xác định tình trạng HER2 nhưng hiện nay thường áp dụng hai phương pháp sau: Phương pháp bán định lượng – sử dụng kỹ thuật Hĩa mơ Miễn dịch (IHC- Immunohistochemistry) đểđánh giá thụ thể HER2 - sản phẩm protein của gen HER2 trên bề mặt tế bào; Phương pháp định lượng đánh giá sự khuếch đại gen HER2 là kỹ thuật Lai tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH- Fluorescence in situ hybridization). Trong đĩ, FISH được đánh giá là tiêu chuẩn vàng để xác định sự biểu hiện của gen HER2 trong ung thư vú.
1.3.1 Hĩa mơ miễn dịch (Immunohistochemistry – IHC) [22], [30] 1.3.1.1 Lịch sử phát triển 1.3.1.1 Lịch sử phát triển
Năm 1941, Coons và cộng là những người đầu tiên đánh dấu kháng thể bằng chất nhuộm huỳnh quang và dùng chúng để xác định vị trí kháng nguyên trên mặt cắt mơ. Kỹ thuật này ngày càng phát triển, một số enzyme đã được dùng để đánh dấu kháng thể như peroxidase (Nakane và Pierce, 1966) và alkaline phosphatase (Mason và Sammon, 1978). Keo vàng được phát hiện bởi Faulk và Taylor (1971) cĩ thể sử dụng để phát hiện phản ứng hĩa mơ miễn dịch bằng cả kính hiển vi quang học lẫn kính hiển vi điện tử. Những chất đánh dấu khác bao gồm những phân tử
phĩng xạ và phản ứng miễn dịch được nhận biết bằng phĩng xạ tự ghi. Ngày nay, hĩa mơ miễn dịch đã trở thành một kỹ thuật chủ yếu và được áp dụng rộng rãi trong nhiều phịng thí nghiệm, đặc biệt là trong y học (chẩn đốn lâm sàng).
1.3.1.2 Nguyên tắc
Hĩa mơ miễn dịch là phương pháp định vị kháng nguyên trên mặt cắt của mơ bằng cách sử dụng kháng thể đã được đánh dấu như là thuốc thửđặc hiệu. Nếu cĩ hiện diện kháng nguyên trên mơ (bào tương, màng tế bào, nhân) sẽ cĩ phản ứng
kháng nguyên – kháng thể xảy ra. Sau đĩ đem gắn với hệ thống phĩng đại nhận biết và gắn màu để cĩ thể lưu trữ lâu và quan sát dưới kính hiển vi quang học.
1.3.1.3 Kháng nguyên
Bản chất hĩa học của kháng nguyên thường là các protein, một số khác là carbohydrate. Kháng thể phản ứng với một phần (kháng thể đơn dịng) hay nhiều phần (kháng thể đa dịng) của kháng nguyên tại các vị trí được gọi là “vị trí tiếp xúc” (epitope). Một kháng nguyên thường cĩ nhiều vị trí tiếp xúc tiềm tàng, do đĩ cần được bộc lộ trước khi cho tiếp xúc với kháng thể.
1.3.1.4 Kháng thể
Theo Boenish và cộng sự, năm 2002, kháng thể thuộc nhĩm protein gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin – Ig). Globulin miễn dịch gồm 5 nhĩm chính,
được xếp theo thứ tự giảm dần trong huyết thanh: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE. Trong đĩ IgG và IgM thường được dùng trong hĩa mơ miễn dịch. Kháng thể tiếp xúc với kháng nguyên được gọi là kháng thể thứ nhất. Tùy theo cách sản xuất cĩ 2 loại kháng thể: kháng thểđa dịng và kháng thểđơn dịng.
A B
Hình 1.10: Kháng thểđa dịng và kháng thểđơn dịng
B: Kháng thểđơn dịng phản ứng với một epitope đặc hiệu trên kháng nguyên
Kháng thể đa dịng (polyclonal antibodies): được tạo ra bằng cách gây miễn dịch ở động vật với kháng nguyên đặc hiệu. Động vật đáp ứng miễn dịch và tạo ra kháng huyết thanh bao gồm nhiều loại kháng thể đặc hiệu và khơng đặc hiệu. Kháng thểđa dịng dễ sản xuất và nhạy hơn kháng thểđơn dịng. Tuy nhiên, kháng thể đa dịng cĩ nhược điểm là ngay cả sau khi tinh sạch, kháng thể đa dịng vẫn cĩ thể chứa những kháng thể phản ứng khơng đặc hiệu với các kháng nguyên; và cĩ khuynh hướng nhuộm nền cao.
Kháng thểđơn dịng (monoclonal antibody): được sản xuất bằng kỹ thuật u lai. Phương pháp này phối hợp khả năng tạo kháng thể đặc hiệu từ tương bào với lympho bào B ở lách động vật được gây miễn dịch, hình thành nhiều dịng tế bào u lai sản xuất ra kháng thểđặc hiệu. Ưu điểm của kháng thểđơn dịng là độđồng nhất rất cao, rất tinh khiết và đặc hiệu.
Cĩ nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kháng thể như: độ pha lỗng kháng thể, nhiệt
độ ủ, và thời gian ủ.
1.3.1.5 Hệ thống nhận biết
Do phức hợp kháng nguyên – kháng thể khơng thể thấy được dưới kính hiển vi quang học nên cần một hệ thống để hiển thị vị trí cĩ phản ứng kháng nguyên – kháng thể. Hệ thống này gồm 2 phần: kháng thể thứ hai hay kháng thể bắt cầu và hệ
thống phĩng đại dấu hiệu nhận biết.
Kháng thể thứ hai là cầu nối kháng thể thứ nhất với hệ thống phĩng đại dấu hiệu nhận biết, đĩ là kháng thể chống globulin miễn dịch (Ig) của kháng thể thứ
nhất.
Hệ thống phĩng đại dấu hiệu nhận biết gồm một men (enzyme), chất nền (subtrate) và chất màu (chromogen).
Cĩ nhiều phương pháp nhuộm cĩ thể dùng để định vị kháng nguyên. Do đĩ việc lựa chọn phương pháp thích hợp cần dựa trên các thơng số như loại mẫu vật và
độ nhạy yêu cầu.
a. Trực tiếp (direct method)
Hình 1.11 : Phương pháp trực tiếp
Đây là phương pháp cổ điển nhất. Một kháng thể sơ cấp được đánh dấu enzyme phản ứng với kháng nguyên trên mơ, sau đĩ sử dụng cơ chất tạo màu để (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});