Quy trình nhuộm IHC gồm 5 bước chính như sau:
Bước 1: Cắt mẫu
Mẫu đã được cố định trong paraffin, đem cắt bằng máy microtome, kích thướt mỗi lát cắt là 4 – 6 μm.
Bước 2: Chuyển mẫu lên lam
Chuyển lát cắt vào nồi thả mơ, sau đĩ dùng lam dương vớt lát cắt lên lam. Bước 3: Khử paraffin
Mẫu sau khi được cốđịnh trên lam, sấy nĩng khoảng 30 phút, rồi nhúng vào xylen 2 lần, mỗi lần 2-5 phút. Sau đĩ chuyển sang cồn khoảng 2-5 phút. Rửa nước. Bước 4: Nhuộm IHC gồm các bước sau:
– Bộc lộ kháng nguyên trong Microwave với dung dịch Citrat pH = 6. Sau đĩ để nguội khỏang 20 phút và cho lên giá nhuộm. Rửa bằng TBS.
– Nhỏ khoảng 3 giọt H2O2 ủ 10 phút. Sau đĩ rửa bằng TBS.
– Phủ kháng thể thứ 1 khoảng 30 phút. Rửa TBS.
– Ủ với Biotin trong 30 phút. Rửa TBS.
– Ủ với Streptavidin trong 30 phút. Rửa TBS.
Cắt mẫu Chuyển mẫu lên lam Xử lý mẫu khử paraffin Nhuộm lam Đọc kết quả
– Làm hiển thị màu bằng DAB: 1ml dung dịch pha với 1 giọt DAB, ủ
trong 10 phút. Rửa nước. Sau đĩ ủ Coper sulfat khoảng 3 – 5 phút. Nhuộm tạo nền tương phản bằng cách nhúng lam trong dung dịch Hematoxylin khoảng 2 – 3 phút. Rửa nước. Tiếp theo nhúng vào dung dịch NH4OH rồi rửa lam qua nước, cồn, xylen. Cuối cùng chờ lam khơ và dán lamel với Baume Canada. (Lưu ý cần tránh cĩ bọt khí bên trong)
Bước 5: Đọc kết quả
Xem kết quả bằng kính hiển vi quang học. Đánh giá biểu hiện của HER2 theo bảng điểm của DAKO như sau:
– 0 : Màng tế bào khơng bắt màu
– 1+ : Bắt màu yếu, rải rác trên màng tế bào
– 2 +: Bắt màu vừa trên màng tế bào > 10% tế bào
Hình 2.1: Kết quả biểu hiện protein HER2 trong IHC