a. Chuẩn bị mẫu
Cắt mẫu bằng máy cắt microtome khoảng 4 – 6 μm..
Chuyển lát cắt vào nồi nước ấm 40o C, sau đĩ dùng lam dương vớt lát cắt lên. Làm khơ lam.
Sấy lam qua đên ở 56 o C.
b. Khử paraffin trên lam
c. Paraffin pretreatment
- Nhúng lam vào dung dịch Pretreatment ở 80 o C trong 10 phút.
- Rửa nước cất 3 phút. Để khơ lam.
d. Xử lý protease
- Nhúng lam vào dung dịch Protease ở 37 o C trong 10 – 60 phút.
- Rửa nước cất 3 phút. Để khơ lam.
e. Khử nước Xylen 10 phút Xylen 10 phút Xylen 10 phút Cồn 100% 5 phút Cồn 100% 5 phút Cồn 70% (1 phút) Cồn 85% (1 phút) Cồn 100% (1 phút)
f. Giai đoạn biến tính và lai đồng thời, thực hiện trong buồng tối
- Nhỏ mẫu dị trên mẫu với lượng thích hợp. Sau đĩ dán lamel bằng rubber cement.
- Bắt đầu chương trình đồng lai ở 75 o C trong 5 phút và 37 o C trong 18 giờ bằng máy ThermoBrite.
g. Giai đoạn rửa sau lai, thực hiện trong buồng tối
Di chuyển rubber cement từ lam và nhúng lam vào dung dịch 2xSSC 0.3% NP-40 ở nhiệt độ phịng khoảng 1 phút.
Lấy lamel ra khỏi lam. Để lam khơ.
Nhúng lam vào trong dung dịch 2xSSC 0.3% NP-40 ở 72 o C khoảng 2 – 5 phút. Để lam khơ tự nhiên.
h. Giai đoạn nhuộm nhân tế bào, thực hiện trong buồng tối
– Nhỏ DAPI trực tiếp lên mẫu.
– Dán lamel.
– Cất lam trong hộp, giữ ở -20oC, 30 phút trước khi khảo sát dưới kính hiển vi huỳnh quang cĩ bộ lọc kính màu cam, xanh và DAPI.
i. Đọc kết quả
Kết quảđược phân tích theo khuyến cáo của ASCO/CAP 2007, đếm tín hiệu HER2 và CEP17 trên 20 nhân tế bào bướu rời, ở vùng ung thư xâm lấn. Trường hợp FISH khi sử dụng bộ kit PathVysion được xem là khuếch đại khi tỷ lệ HER2/CEP17 >2.2. Khi tỷ lệ HER2/CEP17 <1.8, hoặc cĩ ít hơn 4 tín hiệu ở mỗi nhân, kết quả
nhuộm FISH là khơng khuếch đại (theo Wolff, 2007). Cịn trường hợp tỷ lệ
HER2/CEP17 nằm trong khoảng từ 1.8 đến 2.2 hay cĩ trung bình 4 – 6 tín hiệu ở
mỗi nhân thì kết quả được xem là giáp biên. Những bệnh nhân cĩ kết quả này sẽ được xếp vào nhĩm khơng rõ ràng dù họ nhận cĩ được những lợi ích từ điều trị
Bảng 2.3: Cách đánh giá sự khuếch đại gen HER2 trong FISH
Trường hợp “giáp biên”, cần đếm thêm 20 tế bào khác, và tính tỉ lệ lại. Nếu tỉ lệ vẫn nằm trong khoảng 1,8 – 2,2 thì cần một người khác đọc và đếm lại. Sau đĩ tính trung bình trên 60 tế bào.
Khơng khuếch đại Khuếch đại gen (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.2: Kết quả khuếch đại gen HER2 trong kỹ thuật FISH