1.3.2.1 Lịch sử phát triển [46]
Kỹ thuật lai tại chỗ lần đầu tiên được cơng bố vào những năm cuối của thập niên 60 và đầu những năm thập niên 70. Thử nghiệm lúc đầu được thực hiện bằng
đoạn dị phĩng xạ DNA. Nhưng đoạn dị phĩng xạ lại cĩ nhiều nhược điểm như
Enzyme (Strept)avidin Biotin Kháng thể 2 Kháng thể 1 Kháng nguyên
khơng bảo quản lâu, khơng an tồn cho con người, cần phải vận chuyển, xử lý, lưu trữ theo quy định. Vì những nhược điểm trên, các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát triển kỹ thuật mới thay thế cho kỹ thuật cũ dùng mẫu dị phĩng xạ.
Kỹ thuật FISH được ứng dụng lần đầu tiên vào năm 1980. Kỹ thuật này dùng
đoạn dị biotinylated-DNA và kháng thể đánh dấu huỳnh quang. Năm 1991, việc dùng DNA gắn chất huỳnh quang trong lai tại chỗ nhanh và dễ dàng hơn, đánh dấu thời kỳ của FISH.
1.3.2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật FISH
FISH là kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào và di truyền phân tử. FISH sử
dụng một đoạn dị đặc hiệu gắn tín hiệu huỳnh quang, để phát hiện sự cĩ mặt hoặc vắng mặt của một đoạn gen nào đĩ trên nhiễm sắc thể. Các đoạn dị DNA cĩ đánh dấu huỳnh quang được lai gắn lên các vị trí tương ứng trên nhiễm sắc thể muốn tìm hiểu. Sau lai, sản phẩm được khảo sát dưới kính hiển vi huỳnh quang để tìm tín hiệu của các đoạn dị được lai.
1.3.2.3 Đoạn dị
Đoạn dị thu được từ những đoạn cắt của DNA, sau đĩ được tinh chế và khuếch đại để dùng trong dự án bộ gen người. Do kích thước bộ gen người rất lớn nên cần phải phân chia bộ gen thành từng đoạn nhỏ. Đoạn dị cơ bản dùng trong kỹ
thuật FISH cĩ khoảng 100.000 cặp base.
1.3.2.4 Sự biểu hiện của các gen trong kỹ thuật FISH
DNA-acid deoxyribonucleic, là một phân tử sinh học đơn giản, cĩ vai trị quan trọng trong cuộc sống. DNA nằm trong nhân chứa thiết kế của tất cả các cấu trúc và hoạt động của tế bào. DNA gồm 4 loại nucleotide: adenine (A), guanine (G), cytosine (C), và thymine (T). DNA gồm 2 chuỗi đối song song, cùng uốn quanh một trục trung tâm theo chiều xoắn phải. DNA nhân đơi, tổng hợp 3 loại RNA: RNA ribosom (rRNA), RNA thơng tin (mRNA), RNA vận chuyển. Chuỗi đơi DNA gắn kết với nhau bằng liên kết hydro theo “nguyên tắc bổ sung”: A-T, C-G. Tuy nhiên, liên kết hydro là liên kết yếu, khơng bền vững, nên dễ dàng bị phá hủy hồn tồn, chuỗi đơi DNA bị tách ra thành hai sợi đơn. Hiện tượng này được gọi là biến
tính. Sau đĩ hai chuỗi đơn cĩ thể gắn kết lại với nhau hoặc với một chuỗi đơn tương hợp khác. Các cặp base này lai với nhau rất chính xác, chặt chẽ. Do đĩ, ta cĩ thể gọi các chuỗi acid nucleic mẫu là đoạn dị (đã biết trình tự acid nucleic). Đoạn dị này cĩ thể lai với hỗn hợp acid nucleic tạo ra chuỗi acid nucleic, hoặc những đoạn gen tương hợp trên các chuỗi DNA, RNA.
Hình 1.16: Nguyên tắc của FISH
1.3.2.5 Ứng dụng của kỹ thuật FISH
Kỹ thuật FISH được ứng dụng rộng rãi trong những trường hợp sau:
– Chẩn đốn trước sinh và sau sinh các bất thường nhiễm sắc thể trong bệnh lý di truyền.
– Phát hiện và định vị acid nucleic của virus trong tế bào.
– Định vị các vector biểu hiện trong tế bào khi thực hiện liệu pháp gen.
1.3.3 So sánh phương pháp hĩa mơ miễn dịch và lai tại chỗ gắn huỳnh quang Bảng 1.3: So sánh phương pháp IHC và FISH Bảng 1.3: So sánh phương pháp IHC và FISH
IHC FISH
Dễ thực hiện, nhanh, rẻ
tiển.
Kinh phí khơng quá mắc.
Xác định được mơ học trên tiêu bản.
Cĩ thể lưu trữ trong thời gian dài.
Quá trình xử lý mơ khắt khe (vì protein dễ bị hư khi xử
lý). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đánh giá kết quả chủ quan và bán định lượng.
Khĩ thực hiện, đắt tiền, tốn thời gian hơn.
Kinh phí cao, cần trang bị kính hiển vi huỳnh quang.
Khĩ xác định được vùng carcinơm xâm nhập.
Các tín hiệu huỳnh quang sẽ bị
hủy theo thời gian.
DNA bền hơn protein nên điều kiện xử lý mơ ít khắt khe hơn.
Cách tính điểm khách quan và
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1 ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
Đề tài được thực hiện tại phịng Xét nghiệm Sinh học Phân tử thuộc khoa Giải Phẩu Bệnh – Bệnh viện Ung Bướu Tp. HCM.
2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
300 trường hợp ung thư vú xâm lấn đã được chẩn đốn và nhuộm HE và đánh dấu vùng ung thư xâm lấn tại khoa Giải phẫu bệnh – Bệnh viện Ung Bướu Tp. HCM từ tháng 01/2010 đến 05/2011.
2.3 TIÊU CHUẨN CHỌN MẪU
Đểđáp ứng được đề tài “Khảo sát sự biểu hiện của HER2 bằng phương pháp hĩa mơ miễn dịch và lai tại chỗ gắn huỳnh quang”, chúng tơi đã đưa ra tiêu chuẩn chọn mẫu như sau:
– Mẫu bệnh phẩm được cố định ngay trong dung dịch formol 10% đệm trung tính từ 6 giờ đến 48 giờ.
– Mẫu mơ đã được chẩn đốn trên tiêu bản nhuộm Haematoxylin và Eosin là carcinơm xâm lấn.
– Bệnh nhân khơng hĩa trị trị, xạ trị trước đĩ.
– Các đối tượng nghiên cứu phải cĩ kết quả chẩn đốn lâm sàng, Giải phẫu bệnh, kết quả nhuộm hĩa mơ miễn dịch ER, PR.
2.4 TIÊU CHUẨN LOẠI TRỪ
Khơng thỏa một tiêu chuẩn chọn mẫu nào bất kỳ.
2.5. CÁCH TÍNH CỠ MẪU:
n = [t2p(1-p)]/d2 Trong đĩ: n là cỡ mẫu
p = 19% (tỷ lệ khuếch đại gen trong nghiên cứu của Garcia- Caballero T.)
t = 1,96 với độ tin cậy 95% d = 0,05 (sai số cho phép 5%) => n = 236
2.6 CÁCH LẤY BỆNH PHẨM VÀ XỬ LÝ BỆNH PHẨM
2.6.1 Cốđịnh mơ
Bệnh phẩm được cốđịnh ngay trong dung dịch formol 10% đệm pH trung tính trong 6 giờ - 48 giờ.
2.6.2 Cắt lọc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bệnh phẩm được cắt lọc theo những quy định sau:
– Tuyến vú: cắt 3 mẫu ở mơ bướu
– Núm vú
– Cân cơ ngực ngay dưới da
– Hạch nhĩm I
– Hạch nhĩm II
– Hạch nhĩm III
2.6.3 Xử lý mơ
Cố định mơ
Cắt lọc Xử lý mơ Vùi mơ
Cắt mỏng Nhuộm H&E
Bảng 2.1: Quy trình xử lý mơ tựđộng:
Giai đoạn Dung dịch Thời gian
Định hình mơ Formol 10% 4 giờ Khử nước Cồn 70% 1 giờ Khử nước Cồn 80% 1 giờ Khử nước Cồn 90% 1 giờ Khử nước Cồn 100% 1 giờ Khử nước Cồn 100% 1 giờ Làm sáng mơ Xy len 1 giờ Làm sáng mơ Xylen 1 giờ Làm sáng mơ Xylen 1 giờ
Thấm paraffin Paraffin tan chảy 60-65oC 1 giờ
Thấm paraffin Paraffin tan chảy 60-65oC 1 giờ
2.6.4 Vùi mơ
– Paraffin dùng trong giai đoạn vùi mơ là paraffin tinh khiết, paraffin cơng nghiệp cĩ chứa thành phần sáp ong.
– Hứng sáp nĩng chảy vào khuơn trước khi cho mẫu mơ vào để giúp việc cắt mỏng dễ dàng hơn.
– Sát trùng nhíp lấy mơ.
– Cho mẫu mơ vào khuơn đúc.
– Cho thêm sáp đã nĩng chảy lên khuơn đúc.
– Gắn giá đỡ và làm đơng sáp.
– Gỡ các khối đúc ra khỏi khuơn.
2.6.5 Cắt mỏng
– Thực hiện được việc cắt mơ thành lát mỏng 3-5 µm bằng máy cắt mỏng.
– Thả mẫu cắt vào nồi vớt mơ.
2.6.6 Nhuộm Hematoxylin và eosin
Lam sau khi được trải mẫu, đem sấy khoảng 20 phút, sau đĩ khử paraffin bằng cách nhúng vào xylen 2 lần, mỗi lần khoảng 5 phút. Sau đĩ nhuộm lam bằng máy nhuộm tựđộng.
Bảng 2.2: Quy trình nhuộm tựđộng H&E (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hĩa chất Thời gian (số lần nhúng hoặc giờ) Cồn 5 nhúng Cồn 5 nhúng Cồn 5 nhúng Nước 30 giây Hematoxylin 5 phút Nước 5 nhúng HCl 1% 5 nhúng Litrum carbonat 10% 3 nhúng Cồn 5 nhúng Eosin 3 phút Cồn 5 nhúng Cồn 5 nhúng Cồn 5 nhúng Xylen 5 nhúng Xylen 5 nhúng 2.6.7 Đọc kết quả
Tiêu bản được khảo sát dưới kính hiển vi quang học để chẩn đốn mơ học và
đánh giá mơ học.
2.7 HĨA CHẤT, THIẾT BỊ TRONG PHƯƠNG PHÁP IHC 2.7.1 Hĩa chất 2.7.1 Hĩa chất
Kháng thể c-erB-2, kháng thể thứ hai cĩ gắn Biotin, Streptavidin, dung dịch 3,3’-diaminobenzidine chromogen (DAB). (Bộ kit Dako HerceptestTM )
Hematoxyline, Coper Sulfat, NH4OH, cồn, xylem, TBS, H2O2, nước cất, keo dán Baume Canada.
2.7.2 Thiết bị
Máy cắt, bể điều hịa nhiệt, Microwave, tủ lạnh, tủ sấy, pH kế, máy khuấy từ, kính hiển vi quang học, lam, lamel, micropipette, eppendoff, becher, ống đong, bình tam giác.
2.7.3 Phương pháp thực hiện
Quy trình nhuộm IHC gồm 5 bước chính như sau:
Bước 1: Cắt mẫu
Mẫu đã được cố định trong paraffin, đem cắt bằng máy microtome, kích thướt mỗi lát cắt là 4 – 6 μm.
Bước 2: Chuyển mẫu lên lam
Chuyển lát cắt vào nồi thả mơ, sau đĩ dùng lam dương vớt lát cắt lên lam. Bước 3: Khử paraffin
Mẫu sau khi được cốđịnh trên lam, sấy nĩng khoảng 30 phút, rồi nhúng vào xylen 2 lần, mỗi lần 2-5 phút. Sau đĩ chuyển sang cồn khoảng 2-5 phút. Rửa nước. Bước 4: Nhuộm IHC gồm các bước sau:
– Bộc lộ kháng nguyên trong Microwave với dung dịch Citrat pH = 6. Sau đĩ để nguội khỏang 20 phút và cho lên giá nhuộm. Rửa bằng TBS.
– Nhỏ khoảng 3 giọt H2O2 ủ 10 phút. Sau đĩ rửa bằng TBS.
– Phủ kháng thể thứ 1 khoảng 30 phút. Rửa TBS.
– Ủ với Biotin trong 30 phút. Rửa TBS.
– Ủ với Streptavidin trong 30 phút. Rửa TBS.
Cắt mẫu Chuyển mẫu lên lam Xử lý mẫu khử paraffin Nhuộm lam Đọc kết quả
– Làm hiển thị màu bằng DAB: 1ml dung dịch pha với 1 giọt DAB, ủ
trong 10 phút. Rửa nước. Sau đĩ ủ Coper sulfat khoảng 3 – 5 phút. Nhuộm tạo nền tương phản bằng cách nhúng lam trong dung dịch Hematoxylin khoảng 2 – 3 phút. Rửa nước. Tiếp theo nhúng vào dung dịch NH4OH rồi rửa lam qua nước, cồn, xylen. Cuối cùng chờ lam khơ và dán lamel với Baume Canada. (Lưu ý cần tránh cĩ bọt khí bên trong)
Bước 5: Đọc kết quả
Xem kết quả bằng kính hiển vi quang học. Đánh giá biểu hiện của HER2 theo bảng điểm của DAKO như sau:
– 0 : Màng tế bào khơng bắt màu
– 1+ : Bắt màu yếu, rải rác trên màng tế bào
– 2 +: Bắt màu vừa trên màng tế bào > 10% tế bào
Hình 2.1: Kết quả biểu hiện protein HER2 trong IHC
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.8 HĨA CHẤT, THIẾT BỊ TRONG PHƯƠNG PHÁP FISH 2.8.1 Hĩa chất 2.8.1 Hĩa chất
a. Bộ kit PathVysion: Bộ mẫu dị này lai với gen HER2 (SpectrumOrange) và
chromosome 17 centromere (SpectrumGreen). Bộ kit này gồm cĩ:
- LSI HER2/neu SpectrumOrange/ Cep17 SpectrumGreen DNA Probe
- DAPI Counterstain
- NP-40
- 20X SSC salts
b. Bộ kit Vysis Paraffin Pretreatment Reagent II: gồm cĩ
– Protease Buffer II: 0.2N HCL
– Protease: 2500 – 3000 U/mg protease, lyophilized
Ngồi những bộ kit kể trên, trong FISH cịn dùng những loại hĩa chất khác như xylen, cồn, nước cất, rubber cement.
2.8.2 Thiết bị
Kính hiển vi huỳnh quang, máy cắt microtome, bể điều hịa nhiệt, máy lai Thermobrite, máy lắc, máy ly tâm, máy khuấy từ, máy đo pH, bàn sấy lam, tủ sấy, tủ âm.
2.8.3 Phương pháp nhuộm FISH
a. Chuẩn bị mẫu
Cắt mẫu bằng máy cắt microtome khoảng 4 – 6 μm..
Chuyển lát cắt vào nồi nước ấm 40o C, sau đĩ dùng lam dương vớt lát cắt lên. Làm khơ lam.
Sấy lam qua đên ở 56 o C.
b. Khử paraffin trên lam
c. Paraffin pretreatment
- Nhúng lam vào dung dịch Pretreatment ở 80 o C trong 10 phút.
- Rửa nước cất 3 phút. Để khơ lam.
d. Xử lý protease
- Nhúng lam vào dung dịch Protease ở 37 o C trong 10 – 60 phút.
- Rửa nước cất 3 phút. Để khơ lam.
e. Khử nước Xylen 10 phút Xylen 10 phút Xylen 10 phút Cồn 100% 5 phút Cồn 100% 5 phút Cồn 70% (1 phút) Cồn 85% (1 phút) Cồn 100% (1 phút)
f. Giai đoạn biến tính và lai đồng thời, thực hiện trong buồng tối
- Nhỏ mẫu dị trên mẫu với lượng thích hợp. Sau đĩ dán lamel bằng rubber cement.
- Bắt đầu chương trình đồng lai ở 75 o C trong 5 phút và 37 o C trong 18 giờ bằng máy ThermoBrite.
g. Giai đoạn rửa sau lai, thực hiện trong buồng tối (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Di chuyển rubber cement từ lam và nhúng lam vào dung dịch 2xSSC 0.3% NP-40 ở nhiệt độ phịng khoảng 1 phút.
Lấy lamel ra khỏi lam. Để lam khơ.
Nhúng lam vào trong dung dịch 2xSSC 0.3% NP-40 ở 72 o C khoảng 2 – 5 phút. Để lam khơ tự nhiên.
h. Giai đoạn nhuộm nhân tế bào, thực hiện trong buồng tối
– Nhỏ DAPI trực tiếp lên mẫu.
– Dán lamel.
– Cất lam trong hộp, giữ ở -20oC, 30 phút trước khi khảo sát dưới kính hiển vi huỳnh quang cĩ bộ lọc kính màu cam, xanh và DAPI.
i. Đọc kết quả
Kết quảđược phân tích theo khuyến cáo của ASCO/CAP 2007, đếm tín hiệu HER2 và CEP17 trên 20 nhân tế bào bướu rời, ở vùng ung thư xâm lấn. Trường hợp FISH khi sử dụng bộ kit PathVysion được xem là khuếch đại khi tỷ lệ HER2/CEP17 >2.2. Khi tỷ lệ HER2/CEP17 <1.8, hoặc cĩ ít hơn 4 tín hiệu ở mỗi nhân, kết quả
nhuộm FISH là khơng khuếch đại (theo Wolff, 2007). Cịn trường hợp tỷ lệ
HER2/CEP17 nằm trong khoảng từ 1.8 đến 2.2 hay cĩ trung bình 4 – 6 tín hiệu ở
mỗi nhân thì kết quả được xem là giáp biên. Những bệnh nhân cĩ kết quả này sẽ được xếp vào nhĩm khơng rõ ràng dù họ nhận cĩ được những lợi ích từ điều trị
Bảng 2.3: Cách đánh giá sự khuếch đại gen HER2 trong FISH
Trường hợp “giáp biên”, cần đếm thêm 20 tế bào khác, và tính tỉ lệ lại. Nếu tỉ lệ vẫn nằm trong khoảng 1,8 – 2,2 thì cần một người khác đọc và đếm lại. Sau đĩ tính trung bình trên 60 tế bào.
Khơng khuếch đại Khuếch đại gen
Hình 2.2: Kết quả khuếch đại gen HER2 trong kỹ thuật FISH
2.9 CHỨNG DƯƠNG VÀ CHỨNG ÂM
Mơ ung thư vú đã biết âm tính và dương tính trước đĩ.
2.10 XỬ LÝ SỐ LIỆU: dùng phần mềm SPSS16.0 Tỉ lệ HER2/CÉP 17 Đánh giá Tỉ lệ HER2/CÉP 17 Đánh giá < 1,8 Khơng khuếch đại 1,8 – 2,2 Giáp biên 2,3 – 3,9 Khuếch đại thấp ≥ 4 Khuếch đại cao
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
3.1 PHÂN BỐ BỆNH NHÂN THEO TUỔI Bảng 3.1: Phân bố nhĩm tuổi Độ tuổi Số trường hợp < 35 12 35 - 49 145 ≥ 50 143 Tổng cộng 300 Biểu đồ 3.1: Phân bố tỷ lệ nhĩm tuổi
Trong nghiên cứu này, bệnh nhân nữ cĩ độ tuổi dao động từ 29-82 tuổi, chúng tơi phân bố thành 3 nhĩm: nhĩm < 35 tuổi, nhĩm 35-49 tuổi và nhĩm cịn lại từ 50 tuổi trở lên. Theo biểu đồ 3.1, nhĩm tuổi thường gặp nhất là 35-49 tuổi, chiếm 48,3%, nhĩm ≥ 50 tuổi chiếm 47,7%, cịn lại là nhĩm < 35 tuổi là ít gặp nhất (4%).
Bàn luận:
Trong các nghiên cứu trước, nguy cơ mắc ung thư vú theo suốt cuộc đời người phụ nữ. Người ta nhận thấy rằng nguy cơ mắc bệnh này hiếm gặp ở lứa tuổi dưới 30, tăng dần đến độ tuổi 50, sau mãn kinh tần suất này tăng chậm lại. Tuy nhiên, ở
các nước Âu Mỹ, tần suất mắc carcinơm vú tăng lên theo tuổi và cĩ đến 74% trường hợp là phụ nữđã mãn kinh.
Kết quả của nghiên cứu này phù hợp với nghiên cứu trong nước của tác giả Lê Quốc Sử và cộng sự trên 300 trường hợp, nhĩm tuổi cĩ tỷ lệ cao nhất là 35-49 tuổi, nghiên cứu của tác giả Nguyễn Sào Trung và cộng sự trên 371 trường hợp và nghiên cứu của tác giả Âu Nguyệt Diệu trên 600 trường hợp, nhĩm tuổi cao nhất cũng là nhĩm 35-49 tuổi và nghiên cứu của Silvia Ess và cộng sự trên 4749 trường hợp, nhĩm tuổi cĩ tỷ lệ cao nhất là ≥ 50 tuổi. Bảng 3.2: So sánh phân bố tuổi với các nghiên cứu khác Nghiên cứu Tuổi