Cĩ nhiều phương pháp nhuộm cĩ thể dùng để định vị kháng nguyên. Do đĩ việc lựa chọn phương pháp thích hợp cần dựa trên các thơng số như loại mẫu vật và
độ nhạy yêu cầu.
a. Trực tiếp (direct method)
Hình 1.11 : Phương pháp trực tiếp
Đây là phương pháp cổ điển nhất. Một kháng thể sơ cấp được đánh dấu enzyme phản ứng với kháng nguyên trên mơ, sau đĩ sử dụng cơ chất tạo màu để
phát hiện phản ứng khơng đặc hiệu. Phương pháp này đơn giản, nhanh, cĩ tính đặc hiệu nhưng ít nhạy cảm do thiếu hệ thống phĩng đại dấu hiệu nhận biết nên khơng thểđáp ứng được nhu cầu ngày nay.
b. Gián tiếp hai bước (two – step indirect method)
Hình 1.12: Phương pháp gián tiếp hai bước
Phương pháp này bước đầu cho kháng thể sơ cấp kết hợp với kháng nguyên, sau đĩ bổ sung một kháng thể thứ cấp đánh dấu enzyme kháng lại kháng thể sơ cấp
Enzyme Kháng thể 1 Kháng nguyên Enzyme Kháng thể 2 Kháng nguyên Kháng thể 1
(bây giờ là kháng nguyên), và cuối cùng bổ sung cơ chất tạo màu. Phương pháp này linh hoạt hơn phương pháp trực tiếp vì nhiều loại kháng thể sơ cấp khác nhau từ
cùng một lồi cĩ thể sử dụng với cùng kháng thể thứ cấp cộng hợp. Phương pháp này cũng nhạy hơn phương pháp nhuộm trực tiếp vì nhiều kháng thể thứ cấp sẽ
phản ứng với nhiều epitope khác nhau trên kháng thể sơ cấp và khuếch đại tín hiệu lên nhiều lần nhờ cĩ nhiều enzyme được cốđịnh trên mỗi vị trí đích. Thơng thường kháng thể sơ cấp là kháng thểđơn dịng và kháng thể thứ cấp là kháng thểđa dịng.
c. Gián tiếp ba bước (three-step indirect method)
Hình 1.13: Phương pháp gián tiếp ba bước
Phương pháp này được bổ sung thêm một kháng thểđánh dấu enzyme nữa vào phương pháp gián tiếp hai bước. Hai kháng thể thứ cấp được bố trí theo thứ tựnhư
Hình 1.13. Phương pháp này đặc biệt hữu dụng khi nhuộm những kháng nguyên cĩ ít epitone.
Kháng nguyên Enzyme
Kháng thể 2
d. Phức hợp miễn dịch enzyme tan:
Hình 1.14: Phức hợp miễn dịch enzyme tan
Phương pháp nhuộm này cần cĩ kháng thể sơ cấp, phức hợp miễn dịch hịa tan enzyme – kháng thể kháng enzyme và dung dịch cơ chất. Phức hợp miễn dịch
được tạo ra bằng cách cho enzyme phản ứng với kháng thể của nĩ, loại bỏ kết tủa, thu dịch hịa tan. Kháng thể sơ cấp và kháng thể của enzyme phải tạo ra từ cùng một lồi. Kháng thể thứ cấp phải trực tiếp kháng lại globulin miễn dịch của lồi đĩ. Trước tiên cho kháng thể sơ cấp và phức hợp enzyme – kháng thể kháng enzyme phản ứng với kháng nguyên, sau đĩ bổ sung kháng thể thứ cấp. Kháng thể thứ cấp phải được bổ sung với một lượng thừa để một vị trí Fab sẽ gắn với kháng thể sơ
cấp, vị trí cịn lại gắn với kháng thể trong phức hợp miễn dịch của enzyme. Kháng thể 3 Kháng thể 1 Kháng thể 2 Kháng nguyên Enzyme
e. Phương pháp (strept)avidin-biotin
Hình 1.15a: ABC Hình 1.15b: LAB hay LSAB Hình 1.15: Phương pháp (strept)avidin-biotin
Phần lớn những phương pháp nhuộm ngày nay đều dựa trên ái lực lớn giữa (strept)avidin (Streptomyces avidinii) và avidin (trứng gà) với biotin. Phương pháp này cĩ độ nhạy và khả năng khuếch đại rất cao. Thành phần cơ bản gồm kháng thể
sơ cấp kháng kháng nguyên, kháng thể thứ cấp cĩ gắn biotin kháng kháng thể sơ
cấp, phức hợp enzyme – (strept)avidin-biotin (ABC) hay streptavidin cĩ đánh dấu enzyme (LSAB), và cuối cùng là dung dịch cơ chất. Enzyme đánh dấu thường được sử dụng nhất là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase. Phương pháp LSAB nhạy hơn ABC. Để đáp ứng mục tiêu của đề tài này, chúng tơi sử dụng phương pháp LSAB với kháng thể thứ cấp gắn biotin, phức hợp streptavidin- biotinylated horseradish peroxidase và cơ chất 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) để đánh giá sự biểu hiện của protein HER2.