Kiểm tra các cụm mitose bằng kính hiển vi quang học: đọc số lượng và khảo sát cấu trúc nhiễm sắc thể ít nhất là 20 tế bào cho mỗi bệnh nhân. Lựa chọn những cụm trung kỳ điển hình để phân tích bằng cách ghi nhận lại tọa độ.
Chụp hình bằng kính hiển vi quang điện tử BX51 cĩ kết nối với hệ thống camera. Thu nhận hình ảnh qua phần mềm phân tích nhiễm sắc thể. Sử dụng các tính năng của phần mềm để phân tách và sắp xếp bộ nhiễm sắc thể .
Mơ tả kết quả bằng quy ước của danh pháp di truyền quốc tế ISCN 2009[9].
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ BIỆN LUẬN 3.1. Phân nhĩm đối tượng nghiên cứu
Số liệu nghiên cứu được thống kê từ tháng 3/2008 đến tháng 9/2011 tại phịng xét nghiệm Di truyền tế bào, Trung Tâm Y Khoa Medic. Dựa trên hồ sơ bệnh án và dấu hiệu lâm sàng, tổng kết cĩ 320 cặp vợ chồng vơ sinh hiếm muộn được chỉ định thực hiện nhiễm sắc thể đồ máu. Trong đĩ, sẩy thai liên tiếp là trường hợp gặp nhiều nhất (nhĩm A) 301 cặp, chiếm gần 94,1%; nhĩm thất bại trong thụ tinh ống nghiệm (nhĩm B) 15 cặp, chiếm 4,7% và 4 cặp được chẩn đốn lâm sàng là vơ sinh nguyên phát (nhĩm C) chiếm 1.25% (hình 3.1).
A: Sẩy thai liên tiếp B: IVF thất bại C: Vơ sinh I
Hình 3.1 Phân nhĩm đối tượng khảo sát nhiễm sắc thể
Quan sát nhiễm sắc thể đồ trên 3 nhĩm nghiên cứu, kết quả cho thấy nhĩm A cĩ 247 cặp vơ chồng (82.06%) cĩ nhiễm sắc thể đồ bình thường và 54 (17.94%) cặp cĩ nhiễm sắc thể đồ bất thường. Nhĩm B cĩ 9 cặp (60%) cĩ nhiễm sắc thể đồ bình thường và 6 cặp (40%) cĩ nhiễm sắc thể đồ bất thường. Nhĩm C cĩ 2 cặp (50%) cĩ nhiễm sắc thể đồ bình thường và 2 cặp (50%) cĩ nhiễm sắc thể đồ bất thường (hình 3.2).
1.25% 94.1% 4.7%
0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00% A B C STLT IVF thất bại Vơ sinh I
Hình 3.2. Tỉ lệ bất thường Nhiễm sắc thể đồ trên 3 nhĩm khảo sát
3.2. Các bất thường nhiễm sắc thể quan sát được trong nhĩm vơ sinh hiếm muộn
Trên 640 cá thể khảo sát, tỉ lệ bất thường nhiễm sắc thể quan sát được là 9,69%. Xét trên 320 căp vợ chồng cĩ hiện tượng vơ sinh, tỉ lệ bất thường nhiễm sắc thể xảy ra ở người nam là 11.9%, và ở người nữ là 7.5% (Bảng 3.1).
Bảng 3.1. Tỉ lệ bất thường NST ở các cá thể liên quan trong hiện tượng vơ sinh
Bất thường Tần số %
Nam 38/320 11.88
Nữ 24/320 7.50
Kết quả quan sát bất thường NST cho thấy tỉ bất thường NST quan sát được trên đối tượng Nam (11.88%) cao hơn trên đối tượng Nữ (7.50%) . Ngồi ra các loại bất thường NST trên hai đối tượng cũng cĩ sự khác biệt. 4 loại bất thường NST quan sát được trên nhĩm Nam và 5 loại quan sát được trên nhĩm Nữ. Các bất thường NST được phân loại theo từng nhĩm, cĩ 5 nhĩm bất thường được ghi nhận:
bất thường số lượng, NST marker, Chuyển đoạn, đảo đoạn và biến thể chiều dài. Bất thường NST thuộc nhĩm chuyển đoạn chiếm 37.10 %, xuất hiện trên 10 đối tượng Nam và 13 đối tượng Nữ. Nhĩm đảo đoạn chiếm 11.29%, xuất hiện trên 4 Nam và 3 Nữ. Nhĩm biến thể chiều dài chiếm 46.77%, xuất hiện trên 23 đối tượng Nam và 6 đối tượng Nữ. Nhĩm bất thường số lượng chiếm 3.23 % , xuất hiện trên 1 đối tượng Nam và 1 đối tượng Nữ. Nhĩm NST marker chỉ chiếm 1.61%, xuất hiện trên 1 đối tượng Nữ (Bảng 3.2).
Bảng 3.2 Kết quả nhiễm sắc thể đồ bất thường trên hai nhĩm nam và nữ Nam Nữ Bất thường Nhiễm sắc thể đồ Tsần ố Bất thường Nhiễm sắc thể đồ Tsần ố Số lượng 46,XY/47,XXY 1 Số lượng 47,XXX 1 Nhiễm sắc thể Marker - Nhiễm sắc thể Marker 47,XX,+mar 1 Chuyển đoạn 46,XY,t(1;9)(q43;q34) 1 Chuyển đoạn 46,XX,t(2;8)(q32;q24.1) 1 46,XY,t(1;9)(p11;q12) 1 46,XX,t(2;13)(q33;q33) 1 46,XY,t(5;11)(p14;p12) 1 46,XX,t(2;20)(q35;q11.2) 1 46,XY,t(11;22)(q24;q13) 1 46,XX,t(4;17)(q12;q21) 1 46,XY,t(6;13)(q22;q21.3) 1 46,XX,t(5;10)(q35;10q) 1 46,XY,t(6;9)(q27;p12) 1 46,XX,t(5;12)(p14;q23) 1 46,XY,t(7;8)(q22;q22.4) 1 46,XX,t(5;22)(p14;p11) 1 46,XY,t(2;7)(p13;p15) 1 46,XX,t(6;11)(q15;q23) 1 45,XY,rob(14;21) 1 46,XX,t(7;10)(q22;p13) 1 46,XY,t(7;14;?) 1 46,XX,t(9;10)(q34;p15) 1 45,XX,rob(13;14) 3 Biến thể chiều dài 46,XY,9qh+ 5 Biến thể chiều dài 46,XX,9qh+ 3 46,XY,16qh+ 3 46,XY,Yqh- 9 46,XY,Yqh+ 2 46,XY,14ps+ 1 46,XY,1qh+ 3 46,XX,1qh+ 3 Đảo đoạn 46,XY,inv(9)(p12q13) 4 Đảo đoạn 46,XX,inv(9)(p12q13) 3 (Xem hình trang Phụ lục)
Các loại đột biến NST cĩ thể được phân loại theo sự bất thường NST cân bằng hoặc khơng cân bằng (bảng 3.3). Theo cách phân loại này các bất thường NST
cân bằng trên các đối tượng vơ sinh hiếm muộn khảo sát chiếm 38.71%, và bất thường NST khơng cần bằng chiếm 61.29% (Bảng 3.3).
Bảng 3.3 Phân loại nhiễm sắc thể đồ cân bằng và khơng cân bằng
Nhiễm sắc thể đồ cân bằng Nhiễm sắc thể đồ khơng cân bằng
Nhiễm sắc thể đồ Tsần ố % Nhiễm sắc thể đồ Tần số % 46,XY,t(1;9)(q43;q34) 1 0.16 47,XX,+mar 1 0.16 46,XY,t(1;9)(p11;q12) 1 0.16 45,XY,rob(14;21) 1 0.16 46,XX,t(9;10)(q34;p15) 1 0.16 45,XX,rob(13;14) 3 0.47 46,XX,t(7;10)(q22;p13) 1 0.16 46,XY,t(7;14;?) 1 0.16 46,XX,t(5;10)(q35;10q) 1 0.16 46,XY/47,XXY 1 0.16 46,XY,t(5;11)(p14;p12) 1 0.16 47,XXX 1 0.16 46,XX,t(5;12)(p14;q23) 1 0.16 46,XX,t(5;22)(p14;p11) 1 0.16 46,XY,t(2;7)(p13;p15) 1 0.16 46,XX,t(2;8)(q32;q24.1) 1 0.16 Sự đa hình 46,XX,t(2;13)(q33;q33) 1 0.16 46,XY,14ps+ 1 0.16 46,XX,t(2;20)(q35;q11.2) 1 0.16 46,XY,Yqh- 10 1.56 46,XX,t(6;11)(q15;q23) 1 0.16 46,XY,Yqh+ 2 0.32 46,XY,t(6;13)(q22;q21.3) 1 0.16 46,XY,16qh+ 3 0.48 46,XY,t(6;9)(q27;p12) 1 0.16 46,XY,9qh+ 5 0.48 46,XY,t(7;8)(q22;q22.4) 1 0.16 46,XX,9qh+ 3 0.48 46,XX,t(4;17)(q12;q21) 1 0.16 46,XY,1qh+ 3 0.48 46,XY,inv(9)(q12;q13) 4 0.63 46,XX,1qh+ 3 0.48 46,XX,inv(9)(q12;q13) 3 0.48
3.2.1 Bất thường NST ở Nam
Bất thường về biến thể chiều dài các NST 1, 9, 16 và Y chiếm đa số trên tổng số bất thường ở Nam (60.52 %). Điều này trùng hợp với các nghiên cứu ghi nhận trên thế giới. Chuyển đoạn cân bằng và khơng cân bằng cũng chiếm tỉ lệ khá cao 26.32% tổng số bất thường ở nam Bất thường đảo đoạn quanh tâm nhiễm sắc thể 9 tại vị trí từ 9p12 đến 9q13, chiếm gần 10% trên tổng số ca bất thường nhiễm sắc thể ở nam (Bảng 3.1).
Bất thường về chiều dài NST Y chiếm 28.95% trên tổng số bất thường ở Nam. Ở người nam, quá trình hình thành và phát triển cơ quan sinh dục bao gồm quá trình hình thành và giải phĩng tinh trùng liên quan đến nhiều gen cấu trúc trên NST Y.
3.2.2 Bất thường nhiễm sắc thểở Nữ
Bất thường chuyển đoạn cân bằng và khơng cân bằng chiếm 54.17%, trên tổng số bất thường ở Nữ. Bất thường về đảo đoạn quanh tâm NST 9 chiếm 12.5%, bất thường biến thể chiều dài NST 1 và 9 chiếm 25%. Bất thường về số lượng NST giới tính chỉ xuất hiện trên 1 đối tượng (4.17%) và bất thường NST marker cũng chỉ xuất hiện trên 1 đối tượng (4.17%) (Bảng 3.1)
3.2.3 Mơ tả các kiểu bất thường NST
3.2.3.1 Các kiểu Nhiễm sắc thể đồ cân bằng
Chuyển đoạn cân bằng
Chuyển đoạn cân bằng khả năng tạo 50% giao tử cân bằng và 50% giao tử khơng cân bằng. Sự tổ hợp của giao tử mang chuyển đoạn khơng cân bằng với giao tử bình thường sẽ tạo nên tổ hợp mất cân bằng, và cĩ thể dẫn đến sẩy thai, thai lưu người mẹ.
Qua khảo sát các bất thường cấu trúc NST ở Nam, cĩ 8 trường hợp chuyển đoạn cân bằng giữa hai NST. Hai trường hợp chuyển đoạn cân bằng giữa NST 1 và 9 (Hình 3.1). Hai trường hợp chuyển đoạn cân bằng liên quan đến NST 6 (Hình
3.2). Hai trường hợp chuyển đoạn cân bằng liên quan đến NST số 11 (Hình 3.3). Hai trường hợp chuyển đoạn cân bằng liên quan đến NST 7 (Hình 3.4).
Hình Chuyển đoạn giữa nhiễm sắc thể 9 và 1
Hình 3.3 Chuyển đoạn cân bằng ở nam liên quan đến NST số 1 và 9
Hình 3.5 Chuyển đoạn cân bằng ở nam liên quan đến NST 11
Hình 3.6 Chuyển đoạn cân bằng ở nam liên quan đến NST 7
Kết quả quan sát bất thường NST ở Nữ cho thấy tỉ lệ chuyển đoạn cân bằng giữa hai NST chiếm tỉ lệ 41.67%. Chuyển đoạn cân bằng liên quan đến nhiễm sắc thể 2,5 và 10 cĩ tần suất cao hơn các chuyển đoạn trên nhiễm sắc thể khác. Chuyển đoạn cân bằng liên quan đến NST 2 xuất hiện trên 3 đối tượng (Hình 3.5). Chuyển đoạn cân bằng liên quan đến NST 5 xuất hiện trên 3 đối tượng (Hình 3.6). Chuyển đoạn cân bằng liên quan đến NST 10 xuất hiện trên 2 đối tượng (Hình 3.7). Một trường hợp chuyển đoạn cân bằng giữa NST 4 và 17 (Hình 3.8) và một trường hợp chuyển đoạn cân bằng giữa NST 6 và 11 (Hình 3.9).
Hình 3.7 Chuyển đoạn cân bằng ở nữ liên quan đến nhiễm sắc thể 2
Hình 3.8 Chuyển đoạn cân bằng ở nữ liên quan đến NST 5
Hình 3.9 Chuyển đoạn cân bằng ở nữ liên quan đến NST số 10
Hình 3.10 Chuyển đoạn cân bằng ở nữ giữa nhiễm sắc thể 4 và 17
Đảo đoạn
Qua kết quả khảo sát ghi nhận cĩ 4 trường hợp trường đảo đoạn ở Nam và 3 trường hợp đảo đoạn xuất hiện ở Nữ. Các đảo đoạn đều là đảo đoạn quanh tâm nhiễm sắc thể số 9, đoạn (p12q13) (Phụ lục Hình 1.7 và Hình 1.22)
Trong nghiên cứu này, cĩ 4 trường hợp Nam mang đảo đoạn quanh tâm trên NST 9, trong đĩ cĩ 3 trường hợp là người vợ bị sẩy thai liên tiếp 2-3 lần và một trường hợp vơ sinh nguyên phát do suy sinh dục.
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tơi ghi nhận 3 trường hợp khơng phải đối tượng nghiên cứu về vơ sinh hiếm muộn nhưng mang bất thường đảo đoạn quanh tâm NST 9 đoạn p12q13. Một trường hợp Nam suy sinh dục, một trường hợp Nữ bất thường cơ quan sinh dục ngồi và một trường hợp lưỡng giới.
Đây là bất thường thường gặp trong nhiều nghiên cứu khảo sát về nhiễm sắc thể đồở người. Bất thường cấu trúc này là cân bằng và được xem là khơng nguy hại và người mang bất thường này cĩ kiểu hình bình thường. Tuy nhiên nhiều báo cáo về bất thường này đã gây nhiều tranh cãi vì chỉ ra rằng nĩ cĩ thể dẫn đến vơ sinh. Tỉ lệ này chiếm 1.98% trong dân số [35]. Như vậy, Nhiễm sắc thể số 9, vùng dưới tâm động cĩ thể cĩ các gen liên quan đến sự phát triển sinh dục ở cả nam và nữ, do đĩ khi bất thường ở nhiễm sắc thể số 9, đặc biệt là đảo đoạn quanh tâm đoạn (p12q13) cĩ ảnh hưởng đến khả năng sinh sản. Như vậy, ở các bệnh nhân nam vơ sinh mang đảo đoạn này cĩ sự rối loạn sinh tinh cĩ thể cĩ sự liên quan đến nhau. Cĩ thể đảo đoạn khơng liên quan đến một sự mất mát thơng tin di truyền, nhưng cĩ sự sắp xếp lại trình tự gen. Đối với trường hợp này, chúng tơi đề nghị ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phân tích gen và khả năng tái sắp xếp lại gen trong vùng này. Các gen trong vùng này cĩ liên quan đến sự hình thành và biệt hĩa giới tính, cĩ liên quan đến vơ sinh hiếm muộn cần được nghiên cứu sâu hơn.
Hình 3.12Đảo đoạn quanh tâm nhiễm sắc thể 9
3.2.3.2 Các kiểu Nhiễm sắc thể đồ khơng cân bằng
Bất thường về số lượng nhiễm sắc thể giới tính (lệch bội)
Trong khảo sát, trường hợp bất thường số lượng nhiễm sắc thểở Nam ở dạng khảm rất hiếm, chiếm 1/320 Nam được khảo sát. Trường hợp này ở dạng khảm 46,XX/47,XXY, người nam khơng vơ sinh hồn tồn như hội chứng Klinefelter (47,XXY). Người vợ cĩ 1 lần thai lưu ở 7 tháng, một lần thai dị tật bẩm sinh phải chấm dứt thai kỳ và 2 lần sẩy thai. Sau khi khảo sát nhiễm sắc thể đồ vợ chồng, người chồng được phát hiện bất thường khảm hai dịng tế bào 46,XY/47,XXY (xem Phụ lục- Hình 1.9), trong khi người vợ cĩ nhiễm sắc thể đồ bình thường.
Khảo sát trên 320 nữ, cĩ một trường hợp 47,XXX (xem Phụ lục- Hình 1.23). Bệnh nhân này đã từng sẩy thai 1 lần, 1 lần sinh non. Khi đến xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ, bệnh nhân này đang mắc phải tình trạng tắt kinh và suy buồng trứng.
Nhiễm sắc thể marker
Kết quả khảo sát ghi nhận cĩ một trường hợp nữ cĩ bộ nhiễm sắc thể là 47,XX,+mar (xem Phụ lục – Hình 1.24). Đây là trường hợp duy nhất ghi nhận được ở loại bất thường này. Bệnh nhân này đã từng sẩy thai liên tiếp 3 lần ở tuổi thai 5-7 tuần tuổi. Trường hợp này, người chồng cĩ kết quả nhiễm sắc thể đồ bình thường. Trường hợp này cĩ thể nhận định là nhiễm sắc thể mar cĩ thểảnh hưởng đến sự sẩy thai liên tiếp ở người mẹ. Tuy nhiên, rất khĩ khăn để kết luận rằng nhiễm sắc thể
marker cĩ ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển của thai kỳ. Khi vai trị chính xác của nhiễm sắc thể marker trong sẩy thai khơng xác định được thì cĩ rất ít giá trị tiên đốn cho lần mang thai tiếp theo. NST marker cần được xác định rõ nguồn gốc bằng kỹ thuật FISH để cĩ tiên lượng chính xác hơn.
Chuyển đoạn Robertson
Kết quả khảo sát ghi nhận cĩ hai loại chuyển đoạn Robertson. Ở Nam, một trường hợp chuyển đoạn Robertson nhiễm sắc thể 14 và 21 (Hình 3.11). Ở nữ, cĩ 3 trường hợp chuyển đoạn Robertson giữa nhiễm sắc thể 13 và 14 (Hình 3.12).
Hình 3.13 Chuyển đoạn Robertson giữa NST 14 và 21
Hình 3.14 Chuyển đoạn Robertson giữa NST 13 và 14
Các cá thể mang bất thường chuyển đoạn Robertson cĩ kiểu hình hồn tồn bình thường mặc dù cĩ 45 chiếc NST. Tuy nhiên, nguy cơ khi tạo giao tử bất
thường là 50% nên hợp tử hình thành sẽ thừa một chiếc NST (trisomy) hoặc thiếu một chiếc NST (monosomy). Hầu hết các hợp tử hình thành khơng thể tồn tại ngoại trừ trường hợp trisomy 21 (Hội chứng Down) cĩ thể sống đến trưởng thành như người bình thường nhưng thiểu năng trí tuệ.
Sự đa hình (Polymorphic chromosomal Variants)
Qua khảo sát nghiên cứu cho thấy tỉ lệ bất thường về sự đa hình hay biến thể về chiều dài chiếm ở Nam 37.10% và ở Nữ 9.68%. Kết quả cho thấy bất thường này ở Nam cao hơn Nữ. Các trường hợp ghi nhận được liên quan đến NST 1, 9, 14, 16 và Y như 1qh+, 9qh+, 16qh+, 14ps+, Yqh+ và Yqh- (Bảng 3.2). Về cơ chế ảnh hưởng đến nay vẫn chưa được hiểu rõ ngoại trừ Yqh- hay Yqh+, cĩ thể liên quan đến sự mất rối loạn gen ảnh hưởng đến biệt hĩa tinh trùng (Hình 3.15). Trong 10 trường hợp bất thường Yqh- thì cĩ 3 trường hợp tinh trùng yếu và 2 trường hợp khơng cĩ tinh trùng. Tuy nhiên ở người bình thường, kích thước NST Y rất thay đổi, do đĩ chỉ dựa vào cấu trúc NST Y qua nhuộm băng GTG thì trong một số trường hợp sẽ khơng chính xác. Vì vậy, cần khảo sát bất thường NST Y trên vùng a,c và d sử dụng các STS (sequence-tagged site) bằng phản ứng khuếch đại chuỗi.
Các kết quả này phù hợp với các nghiên cứu tương tự cho thấy vẫn chưa xác định được mối quan hệ giữa biến thể chiều dài NST và vơ sinh [36]. Tuy nhiên khi khảo sát trên nhĩm người vơ sinh, hiếm muộn tỉ lệ bất thường về đa hình chiều dài chiếm tỉ lệ cao hơn các bất thường khác (Hình 3.17).
Hình 3.16 Tăng chiều dài cánh dài nhiễm sắc thể 16
Hình 3.17 Tăng chiều dài vệ thể trên cánh ngắn NST 14
Hình 3.18 Biến thể chiều dài NST Y Yqh+ Y Yqh-
Hình 3.19 Biến thể về chiều dài NST 1
Như vậy, sau khi phân tích kết quả theo cá thể trên hai nhĩm nam và nữ, bất thường ở Nam nhiều hơn Nữ và chủ yếu trên nhiễm sắc thể Y. Bất thường ở nam chủ yếu là biến thể về chiều dài nhiễm sắc thể 1, 9, 16 và Y. Các chuyển đoạn cân bằng xuất hiện ở các nhiễm sắc thể 1,2,6,7,8, 9,và 14. Ở nữ, bất thường chuyển đoạn xảy ra hầu nhưở tất cả các nhiễm sắc thể. Ở Nữ, bất thường đảo đoạn quanh tâm nhiễm sắc thể 9, inv(9)(p12q13); biến thể chiều dài nhiễm sắc thể 1 và 9 cũng giống tương tự nhưở Nam.
3.3 Mối liên quan giữa bất thường NST và hiện tượng vơ sinh quan sát trên các cặp vợ chồng cặp vợ chồng
Hiện tượng vơ sinh, hiếm muộn xảy ra cĩ thể xuất phát từ người chồng hoặc người vợ. Các bất thường NST trên người chồng hoặc người vợ đều cĩ thể đẫn đến vơ sinh. Do đĩ, việc khảo sát bất thường về di truyền trong mối liên quan với vơ